本文關(guān)鍵詞：梅毒螺旋體黏附素Tp0751抗原表位的預(yù)測(cè)與鑒定

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【摘要】：目的：篩選和鑒定梅毒螺旋體(Treponema pallidum, Tp)粘附素Tp0751潛在的B表位、Th表位或聯(lián)合Th-B表位，為Tp多價(jià)表位疫苗的深入研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和基礎(chǔ)。 方法： （1） Tp0751蛋白抗原表位預(yù)測(cè)：從Genbank查獲Tp0751蛋白的氨基酸序列，運(yùn)用SYFPEITHI、HLAPrep、IEDB等軟件分析該蛋白的HLA-II類限制性Th細(xì)胞表位；利用EMBOSS和IEDB等在線軟件分析該段氨基酸親水性、β-轉(zhuǎn)角、抗原性、表面可及性等特性，綜合分析預(yù)測(cè)Tp0751蛋白的B表位；以上結(jié)果重疊部分預(yù)測(cè)為聯(lián)合B-Th細(xì)胞表位。 （2） Tp0751蛋白抗原表位多肽人工合成與鑒定：反相高效液相色譜(RP—HPLC)人工合成和純化預(yù)測(cè)的表位多肽，質(zhì)譜分析鑒定合成的多肽。 （3） Tp0751蛋白原核表達(dá)與抗原性鑒定：構(gòu)建pET28a(+)/Tp0751的原核表達(dá)重組載體(不含信號(hào)肽氨基酸編碼序列)，經(jīng)雙酶切、PCR和測(cè)序鑒定后轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)表達(dá)菌誘導(dǎo)表達(dá)；Western blot和SDS-PAGE分別鑒定經(jīng)Ni-NTA純化的目的蛋白的抗原性和表達(dá)形式；以Ni-NTA親和層析法純化目的蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。 （4）兔血清與脾細(xì)胞制備及重組蛋白免疫性測(cè)定：將重組Tp0751經(jīng)皮下注射新西蘭兔共5次，分別收集血清，以重組蛋白檢測(cè)抗體效價(jià)，鑒定其免疫原性，并用于Tp0751的B細(xì)胞表位鑒定；末次免疫后第10天，采集兔脾細(xì)胞，，用于Tp0751的Th細(xì)胞表位鑒定。 （5） Tp0751的B細(xì)胞表位鑒定：分別以預(yù)測(cè)為B/B-Th表位的合成多肽和重組表達(dá)蛋白為包被抗原包被微孔板，梅毒陽(yáng)性病人血清和免疫兔血清為一抗，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照組，間接ELISA法檢測(cè)鑒定預(yù)測(cè)的Tp0751B細(xì)胞表位或聯(lián)合B-Th細(xì)胞表位。 （6） Tp0751的Th細(xì)胞表位鑒定：以預(yù)測(cè)為T/Th-B表位的合成短肽刺激培養(yǎng)兔脾細(xì)胞，同時(shí)設(shè)立ConA和重組Tp0751全蛋白刺激組為陽(yáng)性對(duì)照，PBS刺激組為陰性對(duì)照，CCK-8法檢測(cè)刺激兔脾細(xì)胞的增殖水平，Realtime-PCR測(cè)定IL-4和INF-γ mRNA水平，鑒定Th細(xì)胞表位。 結(jié)果： （1） Tp0751蛋白抗原表位預(yù)測(cè)：分析總結(jié)在線軟件預(yù)測(cè)出P1(65-83AA)、P2(90-101AA)、P3(127-137AA)、P4(221-237AA)、P5(175-185AA)為Tp0751候選B細(xì)胞表位；P5(175-185AA)、P6(103-113AA)、P7(162-171AA)為候選Th細(xì)胞表位；P5(175-185AA)為候選聯(lián)合Th-B表位。 （2）人工合成多肽：質(zhì)譜檢測(cè)合成多肽相對(duì)分子質(zhì)量，測(cè)定值與理論值相符；RP-HPLC法測(cè)定各合成多肽的純度均達(dá)90%以上，滿足實(shí)驗(yàn)要求。 （3） Tp0751蛋白表達(dá)及其抗原性與免疫原性鑒定：酶切及測(cè)序鑒定證實(shí)重組質(zhì)粒pET28a(+)/Tp0751插入片段序列與GenBank登錄序列完全一致；可溶性表達(dá)約26kDa大小重組蛋白，純化后純度達(dá)95%以上；Western blot顯示，重組蛋白僅與梅毒陽(yáng)性病人血清產(chǎn)生特異性反應(yīng)；ELISA檢測(cè)免疫兔血清抗Tp0751效價(jià)均在1:12000以上。 （4） Tp0751的B細(xì)胞表位鑒定：ELISA結(jié)果顯示，預(yù)測(cè)表位P4、P5與梅毒患者血清、免疫兔血清均呈陽(yáng)性反應(yīng)，而與健康人血清不反應(yīng)。 （5） Tp0751的Th細(xì)胞表位鑒定：CCK-8法檢測(cè)預(yù)測(cè)多肽刺激的兔脾細(xì)胞無(wú)明顯增殖，Realtime-PCR顯示刺激脾細(xì)胞的IL-4和INF-γ mRNA水平無(wú)明顯增高。 結(jié)論 （1）高效表達(dá)可溶性重組Tp0751蛋白，該蛋白具有良好的免疫原性與抗原性； （2）預(yù)測(cè)的表位P4、P5可能為Tp0751蛋白B細(xì)胞表位； （3）預(yù)測(cè)的表位P5、P6、P7非兔MHC提呈Tp0751蛋白Th細(xì)胞表位。
【關(guān)鍵詞】：梅毒螺旋體 Tp0751 B細(xì)胞表位 Th細(xì)胞表位 粘附素
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R377.1
【目錄】：

• 主要中英文縮寫4-6
• 中文摘要6-8
• ABSTRACT8-11
• 前言11-13
• 實(shí)驗(yàn)材料13-16
• 實(shí)驗(yàn)方法16-30
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果30-39
• 討論39-42
• 結(jié)論42-43
• 參考文獻(xiàn)43-47
• 附錄47-51
• 綜述51-61
• 參考文獻(xiàn)58-61
• 在讀期間科研成果61-62
• 致謝62

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 李勝濤;劉昌文;鄒澤紅;陶愛(ài)林;;MHC-Ⅱ類抗原表位預(yù)測(cè)軟件的對(duì)比評(píng)價(jià)[J];生物醫(yī)學(xué)工程研究;2010年02期

本文編號(hào)：612532