本文關(guān)鍵詞：穩(wěn)定表達(dá)SAV細(xì)胞的建立及其相互作用蛋白的篩選

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【摘要】：目的建立能穩(wěn)定表達(dá)SAV(Salrador Homolog)的人胚胎腎細(xì)胞HEK293細(xì)胞池并從中純化出SAV相互作用蛋白復(fù)合物。方法從人胚胎腎細(xì)胞HEK293中提取RNA,RT-PCR擴(kuò)增得到SAV基因片斷,構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pBabe-SBP-FLAG-SAV。將pBabe-SBP-FLAG-SAV質(zhì)粒和病毒包裝質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞來產(chǎn)生病毒,收獲病毒后感染HEK293細(xì)胞。通過嘌呤霉素篩選直至沒有細(xì)胞死亡并用Western-blot驗證表達(dá)情況。用鏈酶親和素beads從該穩(wěn)定細(xì)胞池中純化SAV相互作用蛋白并通過銀染檢測。結(jié)果 pBabe-SBP-FLAG-SAV真核表達(dá)載體構(gòu)建成功,包裝病毒感染HEK293后通過Western-blot檢測可見SAV蛋白的表達(dá),FLAG beads和鏈酶親和素beads免疫沉淀進(jìn)一步證明了該融合蛋白表達(dá)的正確性。鏈酶親和素純化出的SAV相互作用蛋白復(fù)合物在銀染時可見。結(jié)論成功構(gòu)建了pBabe-SBP-FLAG-SAV真核表達(dá)載體及穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞池,純化得到SAV相互作用蛋白復(fù)合物。為闡明這些蛋白復(fù)合體在Hippo信號通路中的作用提供了可靠信息。
【作者單位】： 吉林大學(xué)第二醫(yī)院藥品管理部;哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥劑部;吉林大學(xué)藥學(xué)院實驗藥理與毒理學(xué)教研室;
【關(guān)鍵詞】： SAV HEK 穩(wěn)定細(xì)胞池 相互作用蛋白
【分類號】：R363
【正文快照】： 近年,關(guān)于調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡的Hippo信號通路的研究備受矚目[1-2]。在哺乳動物細(xì)胞中,由Mst1/2-WW45(LATS1/2-Mob1(YAP/TAZ組成的Hippo信號通路與果蠅中高度同源[1]。自從1995年許田發(fā)現(xiàn)Hippo信號通路第一個成員wts以來[3],哺乳動物細(xì)胞中Hippo信號通路的研究取得了巨大進(jìn)步

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本文編號：603506