本文關(guān)鍵詞：利用合成的基因回路實(shí)現(xiàn)細(xì)胞水平上尿酸穩(wěn)態(tài)控制的實(shí)驗(yàn)研究

  更多相關(guān)文章： 合成生物學(xué) 基因回路 尿酸 穩(wěn)態(tài)控制

【摘要】：合成生物學(xué)是后基因組時(shí)代新興的一門綜合性交叉學(xué)科，也是現(xiàn)代生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域之一。合成生物學(xué)主要是以傳統(tǒng)生物學(xué)為基礎(chǔ)，結(jié)合工程學(xué)、材料學(xué)、計(jì)算科學(xué)等其他學(xué)科技術(shù)，人工合成新的生物網(wǎng)絡(luò)或系統(tǒng)，從而按照設(shè)計(jì)人員預(yù)想，表現(xiàn)出新的功能。近二十年來，合成生物學(xué)研究取得了長(zhǎng)足的發(fā)展，其研究涉及生物醫(yī)藥、能源、材料、生物計(jì)算、軍事應(yīng)用等眾多領(lǐng)域，為解決人類發(fā)展所面臨的若干重大問題帶來新的希望。 尿酸是嘌呤代謝的終產(chǎn)物，微溶于水，易形成尿酸鹽晶體沉淀，是人體內(nèi)主要的代謝產(chǎn)物之一，人體液中尿酸含量的變化可以反映出人體內(nèi)代謝及免疫等身體機(jī)能的狀況。人體內(nèi)尿酸含量高于正常生理范圍時(shí)稱為高尿酸血癥，長(zhǎng)期的高尿酸血癥易導(dǎo)致痛風(fēng)、腫瘤溶解綜合征等疾病。痛風(fēng)是尿酸鹽晶體在關(guān)節(jié)滑膜、軟骨等組織沉積，引發(fā)的異物炎癥反應(yīng)。目前，針對(duì)痛風(fēng)主要使用藥物進(jìn)行治療，包括傳統(tǒng)的別嘌醇等藥物及新型的生物尿酸酶制劑等。傳統(tǒng)藥物安全性較好，但治療效果不明顯，且易引發(fā)嚴(yán)重的副反應(yīng)；新型的生物尿酸酶制劑雖然具有快速、強(qiáng)大的降尿酸作用，但易誘發(fā)急性痛風(fēng)發(fā)作，易引起超敏反應(yīng)和耐藥。合成生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，使研究人員看到了從基因、細(xì)胞水平上實(shí)現(xiàn)尿酸等代謝產(chǎn)物調(diào)控的曙光。有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，耐輻射型球菌基因組中基因片段hucR，可翻譯成具有轉(zhuǎn)錄抑制作用的蛋白HucR，在尿酸的介導(dǎo)下，HucR通過與基因hucO的相互結(jié)合或分離，進(jìn)一步影響hucO下游基因的表達(dá)。 本研究的目的主要是以轉(zhuǎn)錄抑制物基因hucR及其結(jié)合位點(diǎn)基因hucO為基礎(chǔ)，人工合成優(yōu)化的轉(zhuǎn)錄抑制物基因mUTs及其結(jié)合位點(diǎn)的8串聯(lián)結(jié)構(gòu)基因hucO8，將mUTs和hucO8作為標(biāo)準(zhǔn)生物模塊，構(gòu)建具有尿酸感應(yīng)及調(diào)控作用的基因回路，在細(xì)胞水平上研究回路對(duì)尿酸濃度的調(diào)控作用。主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果簡(jiǎn)要概述為以下幾方面： 1、從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲取優(yōu)化的轉(zhuǎn)錄抑制物基因mUTs及其結(jié)合位點(diǎn)的8串聯(lián)結(jié)構(gòu)基因hucO8的序列，優(yōu)化的黃曲霉菌尿酸酶基因smUox的序列，進(jìn)行化學(xué)合成，將含有目的基因mUTs、hucO8和smUox的載體分別命名為pMD18T-mUTs、pMD18T-hucO8和pGH-smUox。 2、以載體pcDNA3.1/V5-his（C）和pMD18T-mUTs為基礎(chǔ)，構(gòu)建優(yōu)化的轉(zhuǎn)錄抑制物表達(dá)載體pcDNA3.1/V5-mUTs；以分泌型堿性磷酸酶（secreted alkalinephosphatase，SEAP）表達(dá)載體pSEAP2-control和載體pMD18T-hucO8為基礎(chǔ)，構(gòu)建含有8串聯(lián)結(jié)構(gòu)基因hucO8的報(bào)告基因表達(dá)載體pSEAP-hucO8；共轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/V5-mUTs和pSEAP-hucO8組成的雙載體回路至HeLa細(xì)胞，通過檢測(cè)轉(zhuǎn)染48h后SEAP的表達(dá)量，驗(yàn)證了雙載體回路的基本原理，證明了回路對(duì)尿酸具有一定的感應(yīng)作用。 3、以雙向共表達(dá)載體pBudCE4.1為基礎(chǔ)，將基因片段mUTs和hucO8-SEAP整合至pBudCE4.1的兩個(gè)多克隆位點(diǎn)區(qū)域，構(gòu)建了雙向共表達(dá)的單載體基因回路pBudCE4.1-SEAP-mUTs，轉(zhuǎn)染至HeLa細(xì)胞，通過檢測(cè)轉(zhuǎn)染48h后SEAP的表達(dá)量，驗(yàn)證了單載體回路的基本原理，證明了單載體回路對(duì)尿酸具有一定的感應(yīng)作用。6 4、以不同摩爾比的pcDNA3.1/V5-mUTs和pSEAP-hucO8或pcDNA3.1/V5-mUTs和pBudCE4.1-SEAP-mUTs共轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，通過分析SEAP表達(dá)量的差異，研究mUTs和hucO8的比例對(duì)回路的影響，結(jié)果表明，一定范圍內(nèi)（本研究所用比例范圍1:1-4:1），隨著mUTs/hucO8的比例增加，mUTs對(duì)hucO8下游基因表達(dá)抑制作用逐漸增強(qiáng)，當(dāng)mUTs/hucO8=4:1時(shí)，mUTs對(duì)hucO8下游基因表達(dá)抑制作用最強(qiáng)。 5、以載體pSEAP-hucO8和pGH-smUox為基礎(chǔ)，構(gòu)建了優(yōu)化的黃曲霉菌尿酸酶表達(dá)載體phucO8-smUox；再以載體phucO8-smUox和pBudCE4.1為基礎(chǔ)，構(gòu)建了優(yōu)化的黃曲霉菌尿酸酶表達(dá)載體pBudCE4.1-smUox，轉(zhuǎn)染至HeLa細(xì)胞，通過檢測(cè)轉(zhuǎn)染48h后培養(yǎng)基中尿酸酶的含量，驗(yàn)證了smUox能在HeLa細(xì)胞中正確表達(dá)；最后以載體pBud4.1-smUox和pBudCE4.1-SEAP-mUTs為基礎(chǔ)，成功構(gòu)建了單載體尿酸調(diào)控回路pBudCE4.1-mUTs-smUox。 6、單獨(dú)轉(zhuǎn)染單載體尿酸調(diào)控回路（pBudCE4.1-mUTs-smUox）或者共轉(zhuǎn)染雙載體尿酸調(diào)控回路（phucO8-smUox、pcDNA3.1/V5-mUTs），通過檢測(cè)轉(zhuǎn)染48h后培養(yǎng)基中尿酸含量，對(duì)比轉(zhuǎn)染前后尿酸含量差異。證明了單載體回路和雙載體回路均具有一定的尿酸調(diào)控能力。本研究首先構(gòu)建了雙載體尿酸感應(yīng)回路，通過檢測(cè)轉(zhuǎn)染后報(bào)告基因SEAP的表達(dá)量，驗(yàn)證了mUTs與hucO8的基本原理及回路對(duì)尿酸的感應(yīng)作用，在此基礎(chǔ)上，通過引入smUox，分別構(gòu)建了雙載體和單載體尿酸調(diào)控回路。相比于單載體回路，雙載體回路的主要優(yōu)點(diǎn)是可以自由控制轉(zhuǎn)染時(shí)mUTs和hucO8的比例，但其同樣具有以下幾方面弊端：1.轉(zhuǎn)染效率不確定，雙載體回路在轉(zhuǎn)染時(shí)無法準(zhǔn)確控制轉(zhuǎn)入HeLa細(xì)胞的mUTs和hucO8的比例；2.共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)操作相對(duì)復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)成本相對(duì)較大；3.雙載體回路在篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系時(shí)，需要通過兩個(gè)不同的篩選標(biāo)記進(jìn)行篩選，篩選難度相對(duì)較大，且篩選過程復(fù)雜。與之相比，單載體回路具有以下幾方面優(yōu)點(diǎn)：1.單獨(dú)轉(zhuǎn)染pBudCE4.1-mUTs-smUox代替了共轉(zhuǎn)染pSEAP-hucO8和pcDNA3.1/V5-mUTs，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作，節(jié)省了實(shí)驗(yàn)成本；2.單載體回路可以有效保證轉(zhuǎn)入HeLa細(xì)胞的mUTs與hucO8的摩爾比，規(guī)避了轉(zhuǎn)染效率不定等因素導(dǎo)致的mUTs與hucO8比例不確定問題；3.單獨(dú)轉(zhuǎn)染只需一個(gè)篩選標(biāo)記，很大程度上方便了后續(xù)研究中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞系的篩選。 綜上所述，本研究以mUTs和hucO8為標(biāo)準(zhǔn)生物模塊，利用合成生物學(xué)的技術(shù)方法，成功構(gòu)建了雙載體及單載體尿酸調(diào)控回路，，驗(yàn)證了回路的作用原理，證明了回路對(duì)尿酸具有感應(yīng)及調(diào)控作用，實(shí)現(xiàn)了在細(xì)胞水平上對(duì)尿酸進(jìn)行調(diào)控的目的。且研究發(fā)現(xiàn)，在一定范圍內(nèi)，生物模塊mUTs與hucO8的摩爾比，會(huì)通過影響hucO8下游基因的表達(dá)，進(jìn)而影響回路對(duì)尿酸的調(diào)控作用。前述研究為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)細(xì)胞水平上尿酸的穩(wěn)態(tài)控制奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：合成生物學(xué) 基因回路 尿酸 穩(wěn)態(tài)控制
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R329.2
【目錄】：

• 目錄3-7
• 中文摘要7-10
• Abstract10-14
• 英文縮略詞表14-15
• 第1章 前言15-22
• 1.1 合成生物學(xué)發(fā)展概述15
• 1.2 合成生物學(xué)的國(guó)內(nèi)外發(fā)展現(xiàn)狀15-17
• 1.2.1 國(guó)外合成生物學(xué)研究進(jìn)展15-16
• 1.2.2 國(guó)內(nèi)合成生物學(xué)研究進(jìn)展16-17
• 1.3 合成生物學(xué)在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用17-18
• 1.4 尿酸及高尿酸血癥18
• 1.4.1 尿酸18
• 1.4.2 高尿酸血癥及其治療18
• 1.5 選題依據(jù)與研究目的18-19
• 1.5.1 選題依據(jù)18-19
• 1.5.2 研究目的19
• 1.6 主要研究?jī)?nèi)容19-20
• 1.6.1 基礎(chǔ)載體的構(gòu)建19-20
• 1.6.2 雙載體基因回路的功能驗(yàn)證20
• 1.6.3 單載體基因回路的構(gòu)建與功能驗(yàn)證20
• 1.6.4 基于 smUox 的基因回路構(gòu)建與功能驗(yàn)證20
• 1.7 技術(shù)路線20-21
• 1.8 研究意義21-22
• 第2章 基礎(chǔ)載體的構(gòu)建22-31
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料22-23
• 2.1.1 菌種和質(zhì)粒22
• 2.1.2 主要試劑和試劑盒22
• 2.1.3 培養(yǎng)基及其他溶液22-23
• 2.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器23
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法23-27
• 2.2.1 化學(xué)合成基因片段 mUTs 和 hucO_823-24
• 2.2.2 質(zhì)粒 DNA 化學(xué)轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 DH5 感受態(tài)24
• 2.2.3 單克隆挑取及菌液培養(yǎng)24
• 2.2.4 菌液保存及復(fù)蘇24
• 2.2.5 大腸桿菌質(zhì)粒 DNA 提取24-25
• 2.2.6 質(zhì)粒 DNA 雙酶切鑒定25-26
• 2.2.7 質(zhì)粒 DNA 雙酶切回收26
• 2.2.8 DNA 瓊脂糖凝膠電泳26
• 2.2.9 DNA 凝膠片段回收26-27
• 2.2.10 目的片段連接27
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果27-29
• 2.3.1 pMD18T-mUTs 和 pMD18T-hucO8酶切驗(yàn)證結(jié)果27-28
• 2.3.2 pSEAP-hucO8的構(gòu)建28-29
• 2.3.3 pcDNA3.1/V5-mUTs 的構(gòu)建29
• 2.4 小結(jié)29-31
• 第3章 雙載體基因回路的功能驗(yàn)證31-43
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料31-32
• 3.1.1 細(xì)胞株和質(zhì)粒31
• 3.1.2 主要試劑和試劑盒31
• 3.1.3 培養(yǎng)基及其他溶液31-32
• 3.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器32
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法32-35
• 3.2.1 HeLa 細(xì)胞復(fù)蘇32
• 3.2.2 HeLa 細(xì)胞傳代培養(yǎng)32-33
• 3.2.3 HeLa 細(xì)胞凍存33
• 3.2.4 細(xì)胞計(jì)數(shù)及接種 24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板33
• 3.2.5 轉(zhuǎn)染用質(zhì)粒提取33-34
• 3.2.6 Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染 HeLa 細(xì)胞34
• 3.2.7 SEAP 化學(xué)發(fā)光檢測(cè)34-35
• 3.2.8 MTT 實(shí)驗(yàn)35
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果35-41
• 3.3.1 轉(zhuǎn)染條件及檢測(cè)時(shí)間摸索35-38
• 3.3.2 回路基本原理驗(yàn)證38-39
• 3.3.3 回路對(duì)尿酸感應(yīng)作用分析39-41
• 3.4 討論41-42
• 3.5 小結(jié)42-43
• 第4章 單載體基因回路的構(gòu)建與功能驗(yàn)證43-57
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料43-45
• 4.1.1 菌種質(zhì)粒及細(xì)胞株43
• 4.1.2 主要試劑和試劑盒43
• 4.1.3 培養(yǎng)基及其他溶液43-44
• 4.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器44-45
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法45-48
• 4.2.1 質(zhì)粒 DNA 轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5 感受態(tài)45
• 4.2.2 單克隆挑取、菌夜培養(yǎng)及質(zhì)粒 DNA 提取45
• 4.2.3 PCR 基因改造45-46
• 4.2.4 PCR 產(chǎn)物回收及連接 T 載體46
• 4.2.5 DNA 雙酶切鑒定46-47
• 4.2.6 DNA 雙酶切回收47-48
• 4.2.7 目的片段連接48
• 4.2.8 細(xì)胞計(jì)數(shù)、鋪板及轉(zhuǎn)染48
• 4.2.9 SEAP 化學(xué)發(fā)光檢測(cè)48
• 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果48-55
• 4.3.1 PCR 改造 mUTs 基因48-49
• 4.3.2 pBudCE4.1-SEAP 的構(gòu)建49-50
• 4.3.3 pBudCE4.1-SEAP 功能驗(yàn)證50-51
• 4.3.4 pBudCE4.1-SEAP-mUTs 的構(gòu)建51-52
• 4.3.5 單載體回路基本功能驗(yàn)證52-54
• 4.3.6 回路對(duì)尿酸感應(yīng)作用分析54-55
• 4.4 討論55-56
• 4.5 小結(jié)56-57
• 第5章 基于 smUox 的基因回路構(gòu)建與功能驗(yàn)證57-73
• 5.1 實(shí)驗(yàn)材料57-59
• 5.1.1 菌種和質(zhì)粒57
• 5.1.2 主要試劑和試劑盒57
• 5.1.3 培養(yǎng)基及其他溶液57-58
• 5.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器58-59
• 5.2 實(shí)驗(yàn)方法59-63
• 5.2.1 基因 smUox 的化學(xué)合成59
• 5.2.2 質(zhì)粒提取59-60
• 5.2.3 DNA 雙酶切鑒定60
• 5.2.4 DNA 雙酶切回收60-61
• 5.2.5 目的片段連接61
• 5.2.6 細(xì)胞計(jì)數(shù)、鋪板及轉(zhuǎn)染61-62
• 5.2.7 尿酸檢測(cè)62
• 5.2.8 尿酸酶檢測(cè)62-63
• 5.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果63-71
• 5.3.1 尿酸和尿酸酶標(biāo)準(zhǔn)曲線63-64
• 5.3.2 phucO8-smUox 的構(gòu)建64-65
• 5.3.3 pBudCE4.1-smUox 的構(gòu)建65-66
• 5.3.4 pBudCE4.1-smUox 功能驗(yàn)證66-67
• 5.3.5 pBudCE4.1-mUTs-smUox 的構(gòu)建67
• 5.3.6 回路對(duì)尿酸調(diào)控作用分析67-71
• 5.4 討論71
• 5.5 小結(jié)71-73
• 總結(jié)與展望73-75
• 總結(jié)73
• 展望73-75
• 參考文獻(xiàn)75-79
• 附錄79-81
• 文獻(xiàn)綜述81-87
• 1 合成生物學(xué)概述81
• 2 合成生物學(xué)的國(guó)內(nèi)外發(fā)展現(xiàn)狀81-83
• 3 合成生物學(xué)在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用83
• 4 展望83-84
• 參考文獻(xiàn)84-87
• 攻讀碩士期間發(fā)表文章、申請(qǐng)專利、參與會(huì)議87-88
• 作者簡(jiǎn)介88-89
• 致謝89-90

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 辛雅雯;曾正英;陳國(guó)良;;痛風(fēng)治療藥物及其研究進(jìn)展[J];中國(guó)藥物化學(xué)雜志;2012年05期

本文編號(hào)：602508