本文關鍵詞：IKIP通過靶向IKKβ負向調節(jié)NF-κB介導的炎性細胞因子的表達

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【摘要】：機體免疫系統(tǒng)中,固有免疫在抵抗外來病原微生物感染中發(fā)揮重要的作用,固有免疫細胞通過模式識別受體(PRR)識別微生物結構上高度保守的病原相關分子模式(PAMP),然后經過一系列的信號級聯反應來調控不同效應分子的表達。其中TOLL樣受體(Toll-like Receptors, TLRs)作為重要的模式識別受體受到廣泛的關注,用相應的配體如LPS, PGN等刺激固有免疫細胞后,TLRs細胞膜內側TIR (Toll/IL-1receptor homologous region)結構域募集MyD88, TRAF6, IKKβ等接頭分子,最終促進NF-κB等轉錄因子的活化,活化的轉錄因子與相應的反應原件結合后,誘導大量的炎性細胞因子、趨化因子等的產生,從而促進炎癥反應的發(fā)生。其中TLR4(Toll-like Receptor4)和TLR2(Toll-like Receptor2)識別LPS和PGN后可以通過活化NF-κB的方式促進IL-6, TNF-α等細胞因子的表達,其產生的炎性細胞因子在清除病原微生物感染中發(fā)揮重要的作用,但是TLRs的過度活化以及相應炎性細胞因子的過度產生,將引發(fā)一系列與炎癥相關的疾病,尤其是自身免疫性疾病。因此,對促炎性細胞因子產生的機制研究顯得尤為重要。 IKB激酶結合蛋白(IKK-interacting protein, IKIP)是人類近期發(fā)現的一個新分子,經過基因剪切后形成3個轉錄體,并翻譯成相應的蛋白分子發(fā)揮功能。有報道稱,X射線照射能促進IKIP的表達,在內皮細胞中,p53可以調控IKIP的表達,在細胞凋亡過程中發(fā)揮重要功能,作者通過酵母雙雜交的實驗發(fā)現IKIP可以與NF-κB上游的激酶IKKβ結合。由于IKKβ介導NF-κB活化的途徑在TLRs信號通路中同樣發(fā)揮著重要作用,因此IKIP是否參與TLRs信號通路,以及是否可以通過影響IKKβ進而調控NF-κB介導的炎癥反應都有待進一步研究。 研究目的： 1、檢測LPS, PGN等TLRs配體刺激巨噬細胞后,IKIP的表達量是否發(fā)生變化； 2、探討IKIP是否影響LPS, PGN等TLRs配體誘導的促炎細胞因子的表達； 3、探討IKIP調控TLRs信號通路中的NF-κB活化的分子機制。 研究方法： 1、LPS, PGN刺激巨噬細胞,檢測IKIP的表達。 C57/B6小鼠腹腔注射淀粉(6%),72小時后,取出誘導產生的的原代腹腔巨噬細胞(Macrophage),經LPS, PGN刺激0、2、4、8、12、24h,Trizol方法提取RNA,并進行反轉錄得到cDNA,最后用PCR方法檢測IKIP在mRNA水平的表達變化。 同樣的方法取出巨噬細胞后,用LPS, PGN刺激相應的時間點,然后收取蛋白,用western-blot的方法檢測IKIP蛋白水平的表達變化。 2、檢測IKIP對促炎細胞因子的作用。 2.1轉染IKIP的siRNA后,western-blot方法檢測IKIP siRNA的干擾效率 將IKIP的干擾RNA (siRNA)及陰性對照干擾RNA (snRNA)轉染入人胚胎腎細胞系HEK293(Human Embryonic Kidney HEK293, HEK293),靜置培養(yǎng)24h,再轉入Flag-IKIP表達載體,24h后收取蛋白,用BCA方法調整濃度一致,western-blot檢測IKIP蛋白水平的變化。 2.2轉染IKIP siRNA后,LPS、PGN刺激巨噬細胞,檢測促炎性細胞因子的表達變化 驗證IKIP相應的siRNA干擾效率后,選取高干擾效率的siRNA,將其轉染入腹腔巨噬細胞,48h后,用LPS刺激巨噬細胞相應時間點,提取RNA,進行反轉錄,利用PCR技術分析炎性細胞因子IL-6, TNF-α以及I型干擾素mRNA水平上的表達變化。 將Flag-IKIP表達載體轉染Hela細胞系,24小時后用LPS刺激相應時間點,RT-PCR方法檢測促炎細胞因子IL-6, TNF-α和I型干擾素的表達變化。將Flag-IKIP表達載體轉染HEK293-TLR2細胞系,4小時后用PGN刺激相應時間點,RT-PCR方法檢測促炎細胞因子IL-6, TNF-α和I型干擾素的表達變化。 3、IKIP對TLRs信號通路中NF-κB活化調控的分子機制研究。 3.1轉染Flag-IKIP表達載體和TLRs信號通路接頭分子表達載體以及NF-κB, IFN-β報告基因質粒后,檢測NF-κB,IFN-β報告基因活性的變化情況 首先將Flag-IKIP表達載體和TLRs信號通路不同的接頭分子的表達載體以及NF-κB, IFN-β報告基因質粒共同轉入HEK293細胞,24小時后,收取細胞,用雙熒光素酶報告基因的方法檢測IKIP對NF-κB報告基因活性的影響以及對IFN-β報告基因活性的影響,分析IKIP影響NF-κB活性的可能靶點。 3.2干擾IKIP后,Western-blot檢測NF-κB及相關內源性蛋白分子的磷酸化情況 將驗證好的siRNA轉染巨噬細胞48h后,用LPS刺激巨噬細胞相應時間點,收取蛋白,調整濃度一致后,western blot方法檢測NF-κB及相關內源性蛋白分子的磷酸化情況,進一步確定IKIP對NF-κB通路的影響。 3.3驗證IKIP與IKKβ的結合 將Flag-IKIP表達載體與HA-IKKP表達載體共同轉入Hela細胞系或HEK293-TLR2細胞系后,分別用LPS或者PGN刺激2h,收取蛋白,通過免疫共沉淀(Immunoprecipitation, IP)方法檢測兩個分子的結合情況。 3.4IKIP對IKK復合物形成的影響。 首先將Flag-IKIP表達載體與HA-IKKβ, HA-IKKα, HA-IKKγ表達載體共同轉入Hela細胞系24小時后,再用LPS刺激相應時間后,收取蛋白,通過免疫共沉淀的方法進一步明確IKIP與IKK復合物中IKKβ分子的結合情況。為進一步明確作用方式,通過劑量競爭實驗,轉染不同劑量的MYC-IKIP表達載體和相同劑量的HA-IKKβ, HA-IKKγ表達載體于Hela細胞,24小時后用LPS刺激相應時間點,收取蛋白,通過免疫共沉淀方法檢測隨著IKIP的劑量的增加,IKKβ與HA-IKKγ結合是否發(fā)生變化。 研究結果： 1、LPS、PGN刺激巨噬細胞后,IKIP的表達量隨著刺激時間的增加發(fā)生明顯上調。 C57/B6小鼠腹腔注射淀粉(6%),72小時后,取出誘導產生的的原代腹腔巨噬細胞(Macrophage),經LPS, PGN刺激0、2、4、8、12、24h,Trizol方法提取RNA,并進行反轉錄得到cDNA,最后用PCR方法檢測發(fā)現,IKIP mRNA的表達隨著時間的增長而顯著增加。 同樣的方法取出巨噬細胞后,用LPS, PGN刺激相應的時間點,然后收取蛋白,用western-blot的方法檢測發(fā)現,隨著刺激時間的增加,IKIP蛋白水平的表達也明顯增加。結論：通過LPS、PGN刺激巨噬細胞,IKIP的表達明顯上調 2、IKIP抑制促炎細胞因子的產生 2.1IKIP siRNA的干擾效果的驗證 將IKIP相應的干擾RNA (siRNA)轉染入HEK293細胞24h后,再轉入Flag-IKIP載體,24h后收取蛋白,用BCA方法調整濃度后, western-blot檢測IKIP蛋白。IKIPsiRNA可以顯著抑制FLAG-IKIP的表達。 2.2IKIP抑制促炎細胞因子的分泌 將驗證好的siRNA轉入原代腹腔巨噬細胞48小時后,再用LPS, PGN分別刺激4小時,8小時,收取細胞,提取RNA,進行反轉錄,后用PCR分析,發(fā)現與對照組相比,干擾IKIP后,促炎因子IL-6, TNF-α的表達明顯上調。而IFN-β無明顯的變化。 把Flag-IKIP載體分別轉入Hela和HEK293-TLR2細胞24小時后,LPS刺激Hela, PGN刺激HEK293-TLR2細胞,提取RNA,進行反轉錄,用PCR方法,與對照組相比,檢測促炎性細胞因子IL-6, TNF-α的表達明顯下調。而IFN-β的表達無明顯的變化。 3、IKIP抑制NF-κB活性。 3.1IKIP抑制NF-κB報告基因的活性 將Flag-IKIP, TLRs信號通路不同的接頭分子以及NF-κB報告質粒,IFN-β報告質粒共轉染HEK293細胞后,24小時后,收取細胞,通過雙熒光素酶報告基因的方法檢測,與對照組相比,IKIP實驗組可顯著降低MyD88、IKK-P所誘導的NF-κB報告質粒的熒光素酶活性。對TRIF, MyD88所介導的IFN-β報告質粒的熒光素酶活性沒有影響,進一步說明IKIP可NF-κB的活化。 3.2Western-blot檢測IKIP對NF-κB相關的內源性蛋白的影響 將驗證好的siRNA轉染巨噬細胞48h后,LPS分別刺激巨噬細胞30分鐘,60分鐘,收取蛋白,用BCA的方法調整蛋白濃度,western blot檢測pIκB,pP65, IκBα, P65的變化,與對照組相比,發(fā)現干擾IKIP后,pIκB, pP65蛋白水平明顯上調；I-KBa降解增加,進一步說明IKIP對NF-κB的活化起到抑制作用。 4、IKIP通過抑制IKKγ結合IKKβ負向調控NF-κB活化 4.1IKIP結合IKKβ 將Flag-IKIP與HA-IKKP載體共同分別轉入Hela細胞,HEK293-TLR2細胞24h后,再用LPS刺激2h,收取蛋白,免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation, IP)的方法,檢測到Flag-IKIP與HA-IKKP兩個分子的結合。結果表明,LPS刺激后可以誘導IKIP結合IKKβ。 4.2IKIP通過與IKKγ競爭的方式結合IKKβ負向調控NF-κB活化 將Flag-IKIP與HA-IKKβ, HA-IKKα, HA-IKKγ載體共同轉入Hela細胞24小時后,再用LPS刺激2h,收取蛋白,通過免疫共沉淀的方法進一步檢測到IKIP僅僅與IKK復合物中IKKβ結合,而不是與其復合物的結合。為進一步明確結合IKKβ, IKIP的作用方式,我們又采取劑量競爭實驗,轉染不同劑量的MYC-IKIP和相同劑量的HA-IKKβ, HA-IKKγ于Hela細胞,LPS刺激2小時后,收取蛋白,IP的方法檢測到隨著IKIP劑量的增加,與IKKβ結合的IKKγ的量減少,表明,IKIP通過與IKKγ競爭結合IKKβ,影響IKK復合物的活性,來發(fā)揮抑制作用的。 結論： 1、LPS、PGN可以誘導巨噬細胞中IKIP的表達量。 2、IKIP抑制LPS、PGN誘導的促炎因子及I型干擾素的產生。 3、IKIP負向調節(jié)NF-κB信號通路。 4、IKIP通過與IKKy競爭結合IKKβ,影響IKK復合物的形成,負向調控NF-κB的活性,發(fā)揮抑制炎癥過度反應的作用。 創(chuàng)新點及意義： 1、本研究首次證實了IKIP可以參與TLRs信號通路的調控,而且通過進一步實驗闡明了這種抑制作用主要機制,即IKIP通過與IKKy競爭結合IKKβ,影響IKK復合物的形成,進而負向調控NF-κB的活性。 2、固有免疫中炎癥反應受到精細的調控,炎癥的過度活化必定會引起一些炎癥性疾病和自身免疫性疾病,本研究為負性調控NF-κB炎癥反應提供了新的實驗證據,為炎癥性疾病的研究、診斷和治療提供了新的思路。
【關鍵詞】：IKIP IKKβ NF-κB 促炎細胞因子
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R392
【目錄】：

• 中文摘要6-12
• ABSTRACT12-17
• 符號說明17-19
• 前言19-25
• 材料和方法25-50
• 結果50-54
• 討論54-58
• 結論58-59
• 附圖59-63
• 參考文獻63-66
• 致謝66-67
• 攻讀學位期間發(fā)表的學術論文目錄67-68
• 學位論文評閱及答辯情況表68

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