本文關(guān)鍵詞：IKIP通過(guò)靶向IKKβ負(fù)向調(diào)節(jié)NF-κB介導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子的表達(dá)

  更多相關(guān)文章： IKIP IKKβ NF-κB 促炎細(xì)胞因子

【摘要】：機(jī)體免疫系統(tǒng)中,固有免疫在抵抗外來(lái)病原微生物感染中發(fā)揮重要的作用,固有免疫細(xì)胞通過(guò)模式識(shí)別受體(PRR)識(shí)別微生物結(jié)構(gòu)上高度保守的病原相關(guān)分子模式(PAMP),然后經(jīng)過(guò)一系列的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)來(lái)調(diào)控不同效應(yīng)分子的表達(dá)。其中TOLL樣受體(Toll-like Receptors, TLRs)作為重要的模式識(shí)別受體受到廣泛的關(guān)注,用相應(yīng)的配體如LPS, PGN等刺激固有免疫細(xì)胞后,TLRs細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)TIR (Toll/IL-1receptor homologous region)結(jié)構(gòu)域募集MyD88, TRAF6, IKKβ等接頭分子,最終促進(jìn)NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子的活化,活化的轉(zhuǎn)錄因子與相應(yīng)的反應(yīng)原件結(jié)合后,誘導(dǎo)大量的炎性細(xì)胞因子、趨化因子等的產(chǎn)生,從而促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。其中TLR4(Toll-like Receptor4)和TLR2(Toll-like Receptor2)識(shí)別LPS和PGN后可以通過(guò)活化NF-κB的方式促進(jìn)IL-6, TNF-α等細(xì)胞因子的表達(dá),其產(chǎn)生的炎性細(xì)胞因子在清除病原微生物感染中發(fā)揮重要的作用,但是TLRs的過(guò)度活化以及相應(yīng)炎性細(xì)胞因子的過(guò)度產(chǎn)生,將引發(fā)一系列與炎癥相關(guān)的疾病,尤其是自身免疫性疾病。因此,對(duì)促炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生的機(jī)制研究顯得尤為重要。 IKB激酶結(jié)合蛋白(IKK-interacting protein, IKIP)是人類近期發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新分子,經(jīng)過(guò)基因剪切后形成3個(gè)轉(zhuǎn)錄體,并翻譯成相應(yīng)的蛋白分子發(fā)揮功能。有報(bào)道稱,X射線照射能促進(jìn)IKIP的表達(dá),在內(nèi)皮細(xì)胞中,p53可以調(diào)控IKIP的表達(dá),在細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要功能,作者通過(guò)酵母雙雜交的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)IKIP可以與NF-κB上游的激酶IKKβ結(jié)合。由于IKKβ介導(dǎo)NF-κB活化的途徑在TLRs信號(hào)通路中同樣發(fā)揮著重要作用,因此IKIP是否參與TLRs信號(hào)通路,以及是否可以通過(guò)影響IKKβ進(jìn)而調(diào)控NF-κB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)都有待進(jìn)一步研究。 研究目的： 1、檢測(cè)LPS, PGN等TLRs配體刺激巨噬細(xì)胞后,IKIP的表達(dá)量是否發(fā)生變化； 2、探討IKIP是否影響LPS, PGN等TLRs配體誘導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子的表達(dá)； 3、探討IKIP調(diào)控TLRs信號(hào)通路中的NF-κB活化的分子機(jī)制。 研究方法： 1、LPS, PGN刺激巨噬細(xì)胞,檢測(cè)IKIP的表達(dá)。 C57/B6小鼠腹腔注射淀粉(6%),72小時(shí)后,取出誘導(dǎo)產(chǎn)生的的原代腹腔巨噬細(xì)胞(Macrophage),經(jīng)LPS, PGN刺激0、2、4、8、12、24h,Trizol方法提取RNA,并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,最后用PCR方法檢測(cè)IKIP在mRNA水平的表達(dá)變化。 同樣的方法取出巨噬細(xì)胞后,用LPS, PGN刺激相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn),然后收取蛋白,用western-blot的方法檢測(cè)IKIP蛋白水平的表達(dá)變化。 2、檢測(cè)IKIP對(duì)促炎細(xì)胞因子的作用。 2.1轉(zhuǎn)染IKIP的siRNA后,western-blot方法檢測(cè)IKIP siRNA的干擾效率 將IKIP的干擾RNA (siRNA)及陰性對(duì)照干擾RNA (snRNA)轉(zhuǎn)染入人胚胎腎細(xì)胞系HEK293(Human Embryonic Kidney HEK293, HEK293),靜置培養(yǎng)24h,再轉(zhuǎn)入Flag-IKIP表達(dá)載體,24h后收取蛋白,用BCA方法調(diào)整濃度一致,western-blot檢測(cè)IKIP蛋白水平的變化。 2.2轉(zhuǎn)染IKIP siRNA后,LPS、PGN刺激巨噬細(xì)胞,檢測(cè)促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)變化 驗(yàn)證IKIP相應(yīng)的siRNA干擾效率后,選取高干擾效率的siRNA,將其轉(zhuǎn)染入腹腔巨噬細(xì)胞,48h后,用LPS刺激巨噬細(xì)胞相應(yīng)時(shí)間點(diǎn),提取RNA,進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,利用PCR技術(shù)分析炎性細(xì)胞因子IL-6, TNF-α以及I型干擾素mRNA水平上的表達(dá)變化。 將Flag-IKIP表達(dá)載體轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞系,24小時(shí)后用LPS刺激相應(yīng)時(shí)間點(diǎn),RT-PCR方法檢測(cè)促炎細(xì)胞因子IL-6, TNF-α和I型干擾素的表達(dá)變化。將Flag-IKIP表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HEK293-TLR2細(xì)胞系,4小時(shí)后用PGN刺激相應(yīng)時(shí)間點(diǎn),RT-PCR方法檢測(cè)促炎細(xì)胞因子IL-6, TNF-α和I型干擾素的表達(dá)變化。 3、IKIP對(duì)TLRs信號(hào)通路中NF-κB活化調(diào)控的分子機(jī)制研究。 3.1轉(zhuǎn)染Flag-IKIP表達(dá)載體和TLRs信號(hào)通路接頭分子表達(dá)載體以及NF-κB, IFN-β報(bào)告基因質(zhì)粒后,檢測(cè)NF-κB,IFN-β報(bào)告基因活性的變化情況 首先將Flag-IKIP表達(dá)載體和TLRs信號(hào)通路不同的接頭分子的表達(dá)載體以及NF-κB, IFN-β報(bào)告基因質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)入HEK293細(xì)胞,24小時(shí)后,收取細(xì)胞,用雙熒光素酶報(bào)告基因的方法檢測(cè)IKIP對(duì)NF-κB報(bào)告基因活性的影響以及對(duì)IFN-β報(bào)告基因活性的影響,分析IKIP影響NF-κB活性的可能靶點(diǎn)。 3.2干擾IKIP后,Western-blot檢測(cè)NF-κB及相關(guān)內(nèi)源性蛋白分子的磷酸化情況 將驗(yàn)證好的siRNA轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞48h后,用LPS刺激巨噬細(xì)胞相應(yīng)時(shí)間點(diǎn),收取蛋白,調(diào)整濃度一致后,western blot方法檢測(cè)NF-κB及相關(guān)內(nèi)源性蛋白分子的磷酸化情況,進(jìn)一步確定IKIP對(duì)NF-κB通路的影響。 3.3驗(yàn)證IKIP與IKKβ的結(jié)合 將Flag-IKIP表達(dá)載體與HA-IKKP表達(dá)載體共同轉(zhuǎn)入Hela細(xì)胞系或HEK293-TLR2細(xì)胞系后,分別用LPS或者PGN刺激2h,收取蛋白,通過(guò)免疫共沉淀(Immunoprecipitation, IP)方法檢測(cè)兩個(gè)分子的結(jié)合情況。 3.4IKIP對(duì)IKK復(fù)合物形成的影響。 首先將Flag-IKIP表達(dá)載體與HA-IKKβ, HA-IKKα, HA-IKKγ表達(dá)載體共同轉(zhuǎn)入Hela細(xì)胞系24小時(shí)后,再用LPS刺激相應(yīng)時(shí)間后,收取蛋白,通過(guò)免疫共沉淀的方法進(jìn)一步明確IKIP與IKK復(fù)合物中IKKβ分子的結(jié)合情況。為進(jìn)一步明確作用方式,通過(guò)劑量競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn),轉(zhuǎn)染不同劑量的MYC-IKIP表達(dá)載體和相同劑量的HA-IKKβ, HA-IKKγ表達(dá)載體于Hela細(xì)胞,24小時(shí)后用LPS刺激相應(yīng)時(shí)間點(diǎn),收取蛋白,通過(guò)免疫共沉淀方法檢測(cè)隨著IKIP的劑量的增加,IKKβ與HA-IKKγ結(jié)合是否發(fā)生變化。 研究結(jié)果： 1、LPS、PGN刺激巨噬細(xì)胞后,IKIP的表達(dá)量隨著刺激時(shí)間的增加發(fā)生明顯上調(diào)。 C57/B6小鼠腹腔注射淀粉(6%),72小時(shí)后,取出誘導(dǎo)產(chǎn)生的的原代腹腔巨噬細(xì)胞(Macrophage),經(jīng)LPS, PGN刺激0、2、4、8、12、24h,Trizol方法提取RNA,并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,最后用PCR方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn),IKIP mRNA的表達(dá)隨著時(shí)間的增長(zhǎng)而顯著增加。 同樣的方法取出巨噬細(xì)胞后,用LPS, PGN刺激相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn),然后收取蛋白,用western-blot的方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn),隨著刺激時(shí)間的增加,IKIP蛋白水平的表達(dá)也明顯增加。結(jié)論：通過(guò)LPS、PGN刺激巨噬細(xì)胞,IKIP的表達(dá)明顯上調(diào) 2、IKIP抑制促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生 2.1IKIP siRNA的干擾效果的驗(yàn)證 將IKIP相應(yīng)的干擾RNA (siRNA)轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞24h后,再轉(zhuǎn)入Flag-IKIP載體,24h后收取蛋白,用BCA方法調(diào)整濃度后, western-blot檢測(cè)IKIP蛋白。IKIPsiRNA可以顯著抑制FLAG-IKIP的表達(dá)。 2.2IKIP抑制促炎細(xì)胞因子的分泌 將驗(yàn)證好的siRNA轉(zhuǎn)入原代腹腔巨噬細(xì)胞48小時(shí)后,再用LPS, PGN分別刺激4小時(shí),8小時(shí),收取細(xì)胞,提取RNA,進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,后用PCR分析,發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比,干擾IKIP后,促炎因子IL-6, TNF-α的表達(dá)明顯上調(diào)。而IFN-β無(wú)明顯的變化。 把Flag-IKIP載體分別轉(zhuǎn)入Hela和HEK293-TLR2細(xì)胞24小時(shí)后,LPS刺激Hela, PGN刺激HEK293-TLR2細(xì)胞,提取RNA,進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,用PCR方法,與對(duì)照組相比,檢測(cè)促炎性細(xì)胞因子IL-6, TNF-α的表達(dá)明顯下調(diào)。而IFN-β的表達(dá)無(wú)明顯的變化。 3、IKIP抑制NF-κB活性。 3.1IKIP抑制NF-κB報(bào)告基因的活性 將Flag-IKIP, TLRs信號(hào)通路不同的接頭分子以及NF-κB報(bào)告質(zhì)粒,IFN-β報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后,24小時(shí)后,收取細(xì)胞,通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因的方法檢測(cè),與對(duì)照組相比,IKIP實(shí)驗(yàn)組可顯著降低MyD88、IKK-P所誘導(dǎo)的NF-κB報(bào)告質(zhì)粒的熒光素酶活性。對(duì)TRIF, MyD88所介導(dǎo)的IFN-β報(bào)告質(zhì)粒的熒光素酶活性沒(méi)有影響,進(jìn)一步說(shuō)明IKIP可NF-κB的活化。 3.2Western-blot檢測(cè)IKIP對(duì)NF-κB相關(guān)的內(nèi)源性蛋白的影響 將驗(yàn)證好的siRNA轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞48h后,LPS分別刺激巨噬細(xì)胞30分鐘,60分鐘,收取蛋白,用BCA的方法調(diào)整蛋白濃度,western blot檢測(cè)pIκB,pP65, IκBα, P65的變化,與對(duì)照組相比,發(fā)現(xiàn)干擾IKIP后,pIκB, pP65蛋白水平明顯上調(diào)；I-KBa降解增加,進(jìn)一步說(shuō)明IKIP對(duì)NF-κB的活化起到抑制作用。 4、IKIP通過(guò)抑制IKKγ結(jié)合IKKβ負(fù)向調(diào)控NF-κB活化 4.1IKIP結(jié)合IKKβ 將Flag-IKIP與HA-IKKP載體共同分別轉(zhuǎn)入Hela細(xì)胞,HEK293-TLR2細(xì)胞24h后,再用LPS刺激2h,收取蛋白,免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation, IP)的方法,檢測(cè)到Flag-IKIP與HA-IKKP兩個(gè)分子的結(jié)合。結(jié)果表明,LPS刺激后可以誘導(dǎo)IKIP結(jié)合IKKβ。 4.2IKIP通過(guò)與IKKγ競(jìng)爭(zhēng)的方式結(jié)合IKKβ負(fù)向調(diào)控NF-κB活化 將Flag-IKIP與HA-IKKβ, HA-IKKα, HA-IKKγ載體共同轉(zhuǎn)入Hela細(xì)胞24小時(shí)后,再用LPS刺激2h,收取蛋白,通過(guò)免疫共沉淀的方法進(jìn)一步檢測(cè)到IKIP僅僅與IKK復(fù)合物中IKKβ結(jié)合,而不是與其復(fù)合物的結(jié)合。為進(jìn)一步明確結(jié)合IKKβ, IKIP的作用方式,我們又采取劑量競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn),轉(zhuǎn)染不同劑量的MYC-IKIP和相同劑量的HA-IKKβ, HA-IKKγ于Hela細(xì)胞,LPS刺激2小時(shí)后,收取蛋白,IP的方法檢測(cè)到隨著IKIP劑量的增加,與IKKβ結(jié)合的IKKγ的量減少,表明,IKIP通過(guò)與IKKγ競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合IKKβ,影響IKK復(fù)合物的活性,來(lái)發(fā)揮抑制作用的。 結(jié)論： 1、LPS、PGN可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中IKIP的表達(dá)量。 2、IKIP抑制LPS、PGN誘導(dǎo)的促炎因子及I型干擾素的產(chǎn)生。 3、IKIP負(fù)向調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)通路。 4、IKIP通過(guò)與IKKy競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合IKKβ,影響IKK復(fù)合物的形成,負(fù)向調(diào)控NF-κB的活性,發(fā)揮抑制炎癥過(guò)度反應(yīng)的作用。 創(chuàng)新點(diǎn)及意義： 1、本研究首次證實(shí)了IKIP可以參與TLRs信號(hào)通路的調(diào)控,而且通過(guò)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)闡明了這種抑制作用主要機(jī)制,即IKIP通過(guò)與IKKy競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合IKKβ,影響IKK復(fù)合物的形成,進(jìn)而負(fù)向調(diào)控NF-κB的活性。 2、固有免疫中炎癥反應(yīng)受到精細(xì)的調(diào)控,炎癥的過(guò)度活化必定會(huì)引起一些炎癥性疾病和自身免疫性疾病,本研究為負(fù)性調(diào)控NF-κB炎癥反應(yīng)提供了新的實(shí)驗(yàn)證據(jù),為炎癥性疾病的研究、診斷和治療提供了新的思路。
【關(guān)鍵詞】：IKIP IKKβ NF-κB 促炎細(xì)胞因子
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• 中文摘要6-12
• ABSTRACT12-17
• 符號(hào)說(shuō)明17-19
• 前言19-25
• 材料和方法25-50
• 結(jié)果50-54
• 討論54-58
• 結(jié)論58-59
• 附圖59-63
• 參考文獻(xiàn)63-66
• 致謝66-67
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄67-68
• 學(xué)位論文評(píng)閱及答辯情況表68

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3 磊華;引領(lǐng)潮流 與時(shí)俱進(jìn)[N];中國(guó)機(jī)電日?qǐng)?bào);2001年

4 張中橋;四醫(yī)大西京醫(yī)院發(fā)現(xiàn) FAS啟動(dòng)子具有腫瘤靶向性[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2007年

5 雙華斌;愛(ài),竟讓我們?nèi)绱烁袆?dòng)[N];中國(guó)教育報(bào);2008年

6 朱恒順;山大一項(xiàng)免疫學(xué)成果通過(guò)鑒定[N];科技日?qǐng)?bào);2002年

7 本報(bào)記者 劉河 于益江 劉仁;回眸“十五”中國(guó)專利獎(jiǎng)[N];中國(guó)知識(shí)產(chǎn)權(quán)報(bào);2006年

8 李天舒;人腦基因剪切體被發(fā)現(xiàn)[N];健康報(bào);2007年

9 魏衍亮;轉(zhuǎn)基因棉花產(chǎn)業(yè)需要專利護(hù)航[N];中國(guó)知識(shí)產(chǎn)權(quán)報(bào);2006年

10 張中橋;FAS啟動(dòng)子 腫瘤細(xì)胞的探測(cè)器[N];健康報(bào);2007年

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 趙曉麗;基于DNA環(huán)調(diào)控的rrnB P1嵌合啟動(dòng)子表達(dá)載體的構(gòu)建及應(yīng)用[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

2 史紅艷;柯薩奇病毒B4單、雙siRNA表達(dá)載體的構(gòu)建及其抗病毒作用研究[D];吉林大學(xué);2006年

3 王虹;Rac1對(duì)卵巢癌細(xì)胞Skov3遷移與侵襲的影響及機(jī)制探討[D];吉林大學(xué);2012年

4 李偉;人類iNOS基因啟動(dòng)子-1026C/A多態(tài)的功能研究[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2010年

5 張力民;HPD、NLK調(diào)控NF-kB通路和TGFβ通路及機(jī)制研究[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2012年

6 許雷;大青楊纖維素合酶基因的克隆與遺傳轉(zhuǎn)化的研究[D];東北林業(yè)大學(xué);2011年

7 喬玉山;砂梨果實(shí)成熟軟化相關(guān)基因的克隆、表達(dá)分析及其表達(dá)載體的構(gòu)建[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

8 楊波;Trim44正性調(diào)控RLR信號(hào)通路的研究[D];中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué);2013年

9 黎川;基于hTERT腫瘤靶向性的酪氨酸酶報(bào)告基因MRI分子成像的實(shí)驗(yàn)研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2012年

10 郭蒸;Rictor在結(jié)腸腫瘤發(fā)展中多向性調(diào)控的研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2012年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 趙學(xué)英;IKIP通過(guò)靶向IKKβ負(fù)向調(diào)節(jié)NF-κB介導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子的表達(dá)[D];山東大學(xué);2013年

2 武標(biāo);Phb2與CLIC1相互作用的初步研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2010年

3 吳波;大腸桿菌（E.coli）冷激蛋白CspA啟動(dòng)子區(qū)調(diào)控表達(dá)機(jī)制初探[D];東北師范大學(xué);2007年

4 宋紅麗;番茄DR8基因啟動(dòng)子的克隆及其調(diào)控初探[D];重慶大學(xué);2007年

5 王海萍;重組線蟲(chóng)抗凝肽的表達(dá)與純化[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2005年

6 陳瑤;大腹園蛛拖絲蛋白基因的克隆和序列分析[D];東華大學(xué);2007年

7 張琳琳;蠟樣芽孢桿菌工程菌的構(gòu)建及α-淀粉酶基因的表達(dá)[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2007年

8 單連慧;重組CHO細(xì)胞高效表達(dá)乙肝表面抗原的研究[D];吉林大學(xué);2004年

9 崔婷;重組嵌合毒素DAB_（389）-IL2的質(zhì)粒構(gòu)建，表達(dá)純化及其mPEG化修飾的研究[D];吉林大學(xué);2005年

10 任道鋒;旋毛蟲(chóng)43kDa抗原基因重組質(zhì)粒pET30a（+）-Ts43的構(gòu)建與表達(dá)[D];鄭州大學(xué);2006年

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本文編號(hào)：592108