發(fā)布時(shí)間：2017-07-29 13:18

  本文關(guān)鍵詞：剛地弓形蟲棒狀體ROP18基因的克隆、表達(dá)及ROP18蛋白抗感染免疫保護(hù)力的研究

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【摘要】：剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)是重要的機(jī)會性致病原蟲,廣泛寄生于人體及動物的組織細(xì)胞內(nèi),引起人獸共患病。據(jù)美國華盛頓大學(xué)醫(yī)學(xué)院的流行病學(xué)家調(diào)查研究估計(jì),人類每四個(gè)人中就有一人感染弓形蟲,但通常只有免疫功能低的人才會因?yàn)楦腥竟蜗x而表現(xiàn)出臨床癥狀。免疫系統(tǒng)正常的人也有可能因此患上嚴(yán)重的眼部疾病或中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病,女性可造成所懷胎兒的先天性缺陷或死亡。 隨著分子生物學(xué)技術(shù)在寄生蟲學(xué)研究領(lǐng)域的應(yīng)用和發(fā)展,弓形蟲疫苗從最早的全蟲疫苗到新近迅速發(fā)展起來的核酸疫苗均取得了很大進(jìn)展。但是弓形蟲滅活疫苗免疫保護(hù)力低,減毒活疫苗有恢復(fù)毒力的風(fēng)險(xiǎn),不能用于人體,而基因工程多肽疫苗的制備費(fèi)用高、抗原性弱、制備過程復(fù)雜,因此,研制一款安全、有效的抗弓形蟲疫苗對于保護(hù)易感人群以及促進(jìn)人類優(yōu)生優(yōu)育具有重要意義。 弓形蟲的頂端復(fù)合體在蟲體侵入宿主細(xì)胞過程中起著重要的作用,其中對棒狀體的研究較為廣泛、深入。作為棒狀體蛋白家族成員之一的ROP18被認(rèn)為是目前發(fā)現(xiàn)的最有可能與弓形蟲入侵人體并在宿主細(xì)胞內(nèi)存活、大量繁殖有關(guān)的影響因子。因此,本文以剛地弓形蟲RH株棒狀體蛋白ROP18為研究對象,探討其是否具有抗原性及免疫保護(hù)作用。 首先提取剛地弓形蟲RH株基因組DNA,通過PCR擴(kuò)增棒狀體蛋白18(TgROP18)基因。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)雙酶切后連接到原核表達(dá)載體pET30a(+),建立重組表達(dá)載體pET30a(+)-TgROP18,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸埃希菌E.coli BL21(DE3),陽性菌落加入異丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)。用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAG)分析重組蛋白TgROP18的表達(dá)情況,同時(shí)以鼠抗弓形蟲血清為一抗,蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)分析該重組蛋白的免疫反應(yīng)性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,PCR擴(kuò)增獲得TgROP18基因,長約1665bp,編碼554個(gè)氨基酸,其中前47個(gè)氨基酸構(gòu)成信號肽序列。菌落PCR、雙酶切和測序結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證重組質(zhì)粒ET30a(+)-TgROP18構(gòu)建成功。SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)證實(shí),經(jīng)IPTG誘導(dǎo)可獲得相對分子質(zhì)量(Mr)為59800的可溶性重組蛋白TgROP18。最終經(jīng)Western blotting分析,該重組蛋白可被鼠抗剛地弓形蟲的血清識別。 確定融合蛋白His-ROP18成功表達(dá)后,誘導(dǎo)小鼠抗攻擊感染實(shí)驗(yàn)。將60只5-6周齡的雌性Balb/c小鼠,體重(18～20)g左右,隨機(jī)分成4組,每組15只。分別接種His-TgROP18-FCA(A組)、His-TgROP18(B組)、弗氏完全佐劑(freund's complete adjuvant,FCA)(C組)和PBS(D組)。經(jīng)腹腔注射,免疫劑量50μ/只,時(shí)間順序?yàn)?d-20d-34d。每次免疫前尾部靜脈采血,收集血清進(jìn)行細(xì)胞因子水平測定。最后一次免疫后1周,對所有小鼠經(jīng)腹腔注射感染含弓形蟲速殖子103-5個(gè)/只,通過觀察小鼠生存率及免疫前后細(xì)胞因子白介素17(interleukin-17,IL-17)、γ干擾素(interferon-γ, IFN-γ)、白介素10(interleukin-10, IL-10)和白介素4(interleukin-4, IL-4)水平的變化分析弓形蟲RH株ROP18蛋白的作用及機(jī)制。結(jié)果A組小鼠IL-4濃度均值54.17ng·L-1, IL-10濃度均值106.88ng·L-1, IL-17濃度均值5.02ng·L-1, INF-γ濃度均值166.96ng·L-1; B組小鼠IL-4濃度均值52.56ng-L-1, IL-10濃度均值103.34ng·L-1, IL-17濃度均值4.99ng·L-1, INF-γ濃度均值142.42ng·L-1; C組小鼠IL-4濃度均值73.06ng·L-1, IL-10濃度均值144.40ng·L-1, IL-17濃度均值13.34ng·L-1, INF-γ濃度均值73.64ng·L-1; D組小鼠IL-4濃度均值68.29ng·L-1, IL-10濃度均值145.29ng·L-1, IL-17濃度均值14.97ng-L-1, INF-y濃度均值76.50ng·L-1。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件單因素分析可知免疫后小鼠與對照組(B、C)相比,實(shí)驗(yàn)組(A、B)小鼠細(xì)胞因子IFN-γ水平明顯升高(P0.05),而IL-10. IL-4. IL-17水平有所降低(P0.05),這些表現(xiàn)均符合各項(xiàng)細(xì)胞因子的生物學(xué)特點(diǎn)。后經(jīng)抗感染免疫攻擊實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)組小鼠與對照組小鼠中位生存期時(shí)間6～7d相比,其中位生存時(shí)間延長至22～25d。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了：1.本實(shí)驗(yàn)室成功克隆TgROP18基因,構(gòu)建重組原核表達(dá)載體pET30a(+)-TgROP18;2.重組蛋白TgROP18具有特異的抗原性；3.重組融合蛋白His-TgROP18對小鼠進(jìn)行免疫后能誘導(dǎo)小鼠機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)免疫應(yīng)答,這為進(jìn)一步研究弓形蟲疫苗以及該蛋白的生物學(xué)功能提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：剛地弓形蟲 棒狀蛋白18 疫苗 強(qiáng)毒株 免疫原性
【學(xué)位授予單位】：河北北方學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R382.5
【目錄】：

• 目錄4-5
• 摘要5-8
• ABSTRACT8-11
• 英文縮寫11-13
• 前言13-15
• 材料與方法15-30
• 結(jié)果30-35
• 附表35-37
• 附圖37-46
• 討論46-51
• 結(jié)論51-52
• 參考文獻(xiàn)52-58
• 綜述 弓形蟲棒狀蛋白家族的最新研究進(jìn)展58-69
• 參考文獻(xiàn)65-69
• 致謝69-71
• 個(gè)人簡歷71

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

1 施沛青;朱書;錢友存;;IL-17的信號傳導(dǎo)及功能研究[J];中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào);2011年04期

2 殷麗天;王芬;孟曉麗;王海龍;劉紅麗;申金雁;殷國榮;;剛地弓形蟲磷酸甘油酸變位酶2基因片段克隆、表達(dá)及抗原性分析[J];中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志;2012年02期

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4 劉轉(zhuǎn)轉(zhuǎn);王海龍;殷國榮;馬廣源;張建中;凡振偉;;剛地弓形蟲peroxiredoxin基因的克隆表達(dá)與免疫原性分析[J];中國人獸共患病學(xué)報(bào);2009年04期

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本文編號：589385