本文關(guān)鍵詞：靶向gyrA基因反義肽肽核酸體外抑制多重耐藥鮑曼不動桿菌生長的研究

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【摘要】：第一部分多重耐藥鮑曼不動桿菌gyrA基因高效反義寡核苷酸序列的篩選 目的:篩選出能與多重耐藥鮑曼不動桿菌gyrA基因的mRNA緊密結(jié)合的反義寡核苷酸序列。方法:利用Mfold、RNA Structure4.6兩種計算機軟件對多重耐藥鮑曼不動桿菌gyrA基因的mRNA進行二級結(jié)構(gòu)分析計算，根據(jù)最低自由能原則在其mRNA局部雜交松弛區(qū)設(shè)計一系列反義寡核苷酸，與體外轉(zhuǎn)錄的地高辛標記的gyrA mRNA進行斑點雜交，根據(jù)雜交信號的強弱驗證其有效性，篩選與gyrA mRNA緊密結(jié)合的反義寡核苷酸序列。結(jié)果:寡核苷酸探針與gyrA mRNA斑點雜交結(jié)果顯示計算機軟件設(shè)計的10條反義寡核苷酸探針中，有5條顯示出雜交信號，其中1條雜交信號最強，能夠與gyrA mRNA穩(wěn)定結(jié)合。結(jié)論:計算機輔助設(shè)計可作為初步篩選靶基因反義序列的方法，斑點雜交可模擬體內(nèi)環(huán)境對設(shè)計的寡核苷酸與靶基因結(jié)合的有效性進行體外驗證，，兩者聯(lián)合應(yīng)用操作簡便快捷，經(jīng)濟有效，可作為一種在體外高通量篩選高效反義序列的方法。 第二部分靶向gyrA基因反義肽肽核酸體外抑制多重耐藥鮑曼不動桿菌生長 目的:研究以gyrA基因為靶點的反義肽核酸(peptide nucleicacid,PNA)對多重耐藥鮑曼不動桿菌gyrA基因表達的抑制作用和體外抗菌活性,探討其作為新型抗感染制劑的潛在應(yīng)用價值。方法:根據(jù)第一部分篩選出的能與多重耐藥鮑曼不動桿菌CY-623生長必需基因gyrA mRNA緊密結(jié)合的反義寡核苷酸序列，合成肽核酸（PNA）PNA1,同時在gyrA基因轉(zhuǎn)錄起始區(qū)設(shè)計一條反義寡核苷酸序列,覆蓋SD序列與起始密碼子AUG,合成肽核酸PNA2。兩條PNA分別與穿膜肽（cellpenetrating peptide，CCPs）序列（KFF）3K連接形成peptide-PNA (PPNA)。分別用不同濃度的PPNA1、PPNA2和堿基錯配的PPNA3以及為連接（KFF）3K的PNA1處理CY-623菌株，37℃培養(yǎng)不同時間后測定細菌OD600值并做平板菌落計數(shù)觀察其對細菌生長的抑制作用。采用逆轉(zhuǎn)錄（RT）-PCR檢測gyrA基因mRNA表達水平觀察其對靶基因表達的作用。結(jié)果: PPNA1、PPNA2均具有明顯的靶基因抑制作用和體外抗菌活性，并且具有時間和濃度依賴性，兩者的最低抑菌濃度分別為5μmol/L和10μmol/L，PPNA1與PPNA2聯(lián)合使用時最低抑菌濃度為10μmol/L,其中PPNA1、PPNA2各5μmol/L。而PPNA3與PNA1對細菌生長無抑制作用。結(jié)論:以gyrA基因為靶的PNA可在體外高效抑制gyrA mRNA的表達并抑制細菌生長，其反義抑制作用具有較強特異性，穿膜肽（KFF）3K可顯著增強PNA的抑制作用，反義抑制策略有望成為對抗多重耐藥鮑曼不動桿菌感染的新方法。
【關(guān)鍵詞】：多重耐藥鮑曼不動桿菌 gyrA 反義寡核苷酸 斑點雜交 肽核酸 gyrA 多重耐藥鮑曼不動桿菌
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R378.99
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對照5-7
• 摘要7-10
• ABSTRACT10-13
• 前言13-15
• 第一部分 多重耐藥鮑曼不動桿菌 gyrA 基因高效反義寡核苷酸序列的篩選15-29
• 前言15
• 1 材料和儀器設(shè)備15-17
• 2 實驗方法17-22
• 3 實驗結(jié)果22-27
• 4 討論27-29
• 第二部分 靶向 gyrA 基因反義肽肽核酸體外抑制多重耐藥鮑曼不動桿菌生長29-39
• 前言29
• 1 材料和儀器設(shè)備29-30
• 2 實驗方法30-33
• 3 實驗結(jié)果33-36
• 4 討論36-39
• 參考文獻39-42
• 全文小結(jié)42-43
• 文獻綜述43-55
• 參考文獻48-55
• 致謝55-56
• 攻讀學位期間發(fā)表的論文56-57

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 王曉博,王升啟;最佳反義藥物的選擇[J];國外醫(yī)學.藥學分冊;2001年03期

2 孟娟;古勤生;林石明;彭斌;劉麗鋒;田延平;李莉;;地高辛標記探針檢測5種葫蘆科作物病毒的斑點雜交方法[J];中國農(nóng)業(yè)科學;2007年12期

本文編號：572627