本文關(guān)鍵詞：微小RNA-214在大鼠心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷中的作用及機(jī)制

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【摘要】：目的：心血管疾病的發(fā)病率和死亡率很高，是危害人類健康的主要疾病之一，關(guān)于心血管疾病在分子學(xué)和基因?qū)W上的發(fā)病機(jī)制的研究倍受學(xué)者們的關(guān)注。研究表明微小RNA（microRNA，miRNA)在心血管的發(fā)生發(fā)育及諸如心肌肥大，心力衰竭，心肌梗死等許多心血管疾病中都扮演重要角色。 在心梗的發(fā)病過程中活性氧化物（reactive oxygen species，ROS）在梗死區(qū)及非梗死區(qū)均增加，ROS可加速心肌缺血，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。更有許多證據(jù)表明ROS作為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中介，具有激活轉(zhuǎn)錄因子及基因表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增長(zhǎng)及凋亡的作用。H_2O_2是ROS的一種，實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常被用來模擬心肌缺氧損傷。許多miRNAs在H_2O_2干預(yù)后的心肌細(xì)胞中的表達(dá)變化以及miRNAs在ROS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷中所起的作用都不確定。此研究旨在探討在H_2O_2損傷的心肌細(xì)胞中miRNA-214的表達(dá)變化，證實(shí)miRNA-214在H_2O_2損傷的心肌細(xì)胞中的作用，并進(jìn)一步研究人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因（PTEN）是否是miRNA-214調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞凋亡的的靶基因。 方法： 1乳鼠心肌細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定。取出生1-3天的SD大鼠乳鼠，低溫麻醉，清洗干凈后開胸，取出心室肌組織剪成小塊，消化液消化，直至組織消化完全，收集消化液過濾、離心、重懸后，在含有13%胎牛血清及1%青鏈霉素的DMEM/F12完全培養(yǎng)基中差速貼壁1h，更換培養(yǎng)瓶再加入0.1mmol/LBrdu來純化心肌細(xì)胞。48h后更換為完全培養(yǎng)基，，以后每2天換一次液。堅(jiān)持每天倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞變化。培養(yǎng)3天后心肌細(xì)胞呈梭形、多角形等不規(guī)則形態(tài)，伸出突起相互連接交織成網(wǎng)，并出現(xiàn)成片同步搏動(dòng)，頻率多為60-100次/分,3-7天細(xì)胞活力均保持較好狀態(tài)，適合實(shí)驗(yàn)研究。 a-actin抗體免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示：心肌細(xì)胞胞質(zhì)被染成棕黃色絲狀結(jié)構(gòu)。心肌細(xì)胞純度鑒定：乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)72h，a-actin陽性率為75%-85%。 2心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型的建立。用H_2O_2誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的原代心肌細(xì)胞損傷。實(shí)驗(yàn)分正常對(duì)照組(normal control)，H_2O_2損傷組(H_2O_2group,濃度分別為10、30、50、100、200μmol/L，作用時(shí)間為6h、12h、24h）。通過MTT比色法檢測(cè)各組細(xì)胞活力，摸索H_2O_2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞氧化損傷的適當(dāng)濃度及時(shí)間。根據(jù)MTT摸索的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型的時(shí)間與濃度，實(shí)驗(yàn)分正常對(duì)照組(normal control)，H_2O_2損傷組(H_2O_2group,濃度分別為30、50、100、200μmol/L，作用時(shí)間為6h）。消化、離心收集細(xì)胞，Annexin V-FITC和PI染色15min后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。進(jìn)一步確定H_2O_2濃度，建立心肌細(xì)胞H_2O_2氧化應(yīng)激損傷模型。 3H_2O_2干預(yù)心肌細(xì)胞后觀察miRNA-214表達(dá)變化。培養(yǎng)的大鼠心肌細(xì)胞給予H_2O_2，分空白對(duì)照組和H_2O_2干預(yù)組（濃度分別為30、50、100μmol/L)干預(yù)6h后提取細(xì)胞中的RNA，用qRT-PCR檢測(cè)miRNA-214的相對(duì)表達(dá)變化。 4AnnexinV/PI方法檢測(cè)不同轉(zhuǎn)染組的心肌細(xì)胞經(jīng)H_2O_2誘導(dǎo)損傷后的細(xì)胞凋亡率變化。原代心肌細(xì)胞經(jīng)72h培養(yǎng)并用轉(zhuǎn)染的方法上調(diào)或下調(diào)miRNA-214的表達(dá)分為正常細(xì)胞組，及不同轉(zhuǎn)染組（miRNA-214前體組、miRNA-214前體空白組、miRNA-214抑制劑組、miRNA-214抑制劑空白組）后各組都用H_2O_2（100μmol/L）誘導(dǎo)6h后用AnnexinV/PI染色細(xì)胞上流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同轉(zhuǎn)染組的心肌細(xì)胞經(jīng)H_2O_2誘導(dǎo)后的凋亡率。 5Western blot檢測(cè)不同干預(yù)組PTEN的蛋白表達(dá)變化培養(yǎng)細(xì)胞分為正常對(duì)照組和H_2O_2（100μmol/L）干預(yù)組以及不同轉(zhuǎn)染組（miRNA-214前體組、miRNA-214前體空白組、miRNA-214抑制劑組），分別提取各組蛋白進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)。 結(jié)果： 1H_2O_2對(duì)心肌細(xì)胞有損傷作用MTT檢測(cè)結(jié)果提示，隨著H_2O_2濃度的升高，作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞活力（OD值）逐漸降低，呈明顯的劑量和時(shí)間依賴性。AnnexinV/PI方法檢測(cè)隨著H_2O_2濃度的升高，細(xì)胞凋亡率逐漸增加，呈明顯的劑量依賴性，說明H_2O_2可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷。我們選擇引起細(xì)胞凋亡30%左右的H_2O_2濃度（100μmol/L）作用6h，建立氧化應(yīng)激損傷模型。 2氧化應(yīng)激損傷后的心肌細(xì)胞中miRNA-214的表達(dá)有變化RT-PCR檢測(cè)到心肌細(xì)胞中miRNA-214的相對(duì)表達(dá)變化具有H_2O_2濃度依賴性。H_2O_2干預(yù)各組之間都有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.05)。 3miRNA-214對(duì)H_2O_2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡有保護(hù)作用。流式結(jié)果表明H_2O_2100μmol/L誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷6h后的miRNA-214前體組細(xì)胞凋亡率較正常細(xì)胞及miRNA-214抑制劑組都低，抑制劑組細(xì)胞凋亡率明顯高于正常組和前體組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05)，而前體空白對(duì)照組、抑制劑空白對(duì)照組與未轉(zhuǎn)染組相比凋亡率變化不大無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05）。說明miRNA-214對(duì)H_2O_2誘導(dǎo)損傷的心肌細(xì)胞有保護(hù)作用。 4PTEN是miRNA-214保護(hù)心肌細(xì)胞凋亡的作用靶基因。抑制了PTEN蛋白活性后，發(fā)現(xiàn)上調(diào)與下調(diào)miRNA-214表達(dá)變化對(duì)氧化應(yīng)激損傷的心肌細(xì)胞凋亡率影響無差別。Western blot檢測(cè)到經(jīng)pre-miRNA-214轉(zhuǎn)染后的心肌細(xì)胞中PTEN的蛋白表達(dá)量下降，而經(jīng)轉(zhuǎn)染anti-miRNA-214的細(xì)胞中PTEN的蛋白表達(dá)量增加，均與對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論： 1H_2O_2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷中miRNA-214的表達(dá)有變化且具有H_2O_2濃度依賴性。正常細(xì)胞、H2O（230、50、100μmol/L）其miRNA-214的表達(dá)隨濃度增加而上升。 2miRNA-214對(duì)H_2O_2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡有保護(hù)作用。miRNA-214表達(dá)上調(diào)可降低心肌細(xì)胞凋亡率，表達(dá)下調(diào)可增加心肌細(xì)胞凋亡。 3PTEN是miRNA-214在調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞凋亡中的靶基因。PTEN的表達(dá)量受miRNA-214的調(diào)節(jié)，miRNA-214上調(diào)后PTEN表達(dá)下降，miRNA-214下調(diào)后PTEN的表達(dá)增加，抑制PTEN活性后miRNA-214對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用變得不明顯。
【關(guān)鍵詞】：microRNA-214 心肌細(xì)胞 H_2O_2 細(xì)胞凋亡 PTEN 細(xì)胞損傷
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R363
【目錄】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-12
• 前言12
• 材料與方法12-26
• 結(jié)果26-30
• 附圖30-38
• 附表38-41
• 討論41-45
• 結(jié)論45
• 參考文獻(xiàn)45-49
• 綜述 微小 RNA 在心肌肥大中的作用及機(jī)制49-56
• 參考文獻(xiàn)53-56
• 致謝56-57
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷57

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 關(guān)欣;李應(yīng)東;馬海彥;劉凱;;新生大鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)分離方法的改進(jìn)[J];中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志;2009年01期

2 吳揚(yáng);耿鵬;王玉琴;劉艷;;MicroRNA-1在心肌肥大中對(duì)L-型鈣通道β_2亞基的負(fù)性調(diào)控作用[J];中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志;2012年04期

本文編號(hào)：568139