本文關(guān)鍵詞：微小RNA-214在大鼠心肌細胞氧化應(yīng)激損傷中的作用及機制

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【摘要】：目的：心血管疾病的發(fā)病率和死亡率很高，是危害人類健康的主要疾病之一，關(guān)于心血管疾病在分子學(xué)和基因?qū)W上的發(fā)病機制的研究倍受學(xué)者們的關(guān)注。研究表明微小RNA（microRNA，miRNA)在心血管的發(fā)生發(fā)育及諸如心肌肥大，心力衰竭，心肌梗死等許多心血管疾病中都扮演重要角色。 在心梗的發(fā)病過程中活性氧化物（reactive oxygen species，ROS）在梗死區(qū)及非梗死區(qū)均增加，ROS可加速心肌缺血，誘導(dǎo)細胞凋亡。更有許多證據(jù)表明ROS作為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中介，具有激活轉(zhuǎn)錄因子及基因表達，促進細胞增長及凋亡的作用。H_2O_2是ROS的一種，實驗中經(jīng)常被用來模擬心肌缺氧損傷。許多miRNAs在H_2O_2干預(yù)后的心肌細胞中的表達變化以及miRNAs在ROS誘導(dǎo)的心肌細胞損傷中所起的作用都不確定。此研究旨在探討在H_2O_2損傷的心肌細胞中miRNA-214的表達變化，證實miRNA-214在H_2O_2損傷的心肌細胞中的作用，并進一步研究人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因（PTEN）是否是miRNA-214調(diào)節(jié)心肌細胞凋亡的的靶基因。 方法： 1乳鼠心肌細胞的分離培養(yǎng)及鑒定。取出生1-3天的SD大鼠乳鼠，低溫麻醉，清洗干凈后開胸，取出心室肌組織剪成小塊，消化液消化，直至組織消化完全，收集消化液過濾、離心、重懸后，在含有13%胎牛血清及1%青鏈霉素的DMEM/F12完全培養(yǎng)基中差速貼壁1h，更換培養(yǎng)瓶再加入0.1mmol/LBrdu來純化心肌細胞。48h后更換為完全培養(yǎng)基，，以后每2天換一次液。堅持每天倒置顯微鏡下觀察細胞變化。培養(yǎng)3天后心肌細胞呈梭形、多角形等不規(guī)則形態(tài)，伸出突起相互連接交織成網(wǎng)，并出現(xiàn)成片同步搏動，頻率多為60-100次/分,3-7天細胞活力均保持較好狀態(tài)，適合實驗研究。 a-actin抗體免疫細胞化學(xué)染色顯示：心肌細胞胞質(zhì)被染成棕黃色絲狀結(jié)構(gòu)。心肌細胞純度鑒定：乳鼠心肌細胞培養(yǎng)72h，a-actin陽性率為75%-85%。 2心肌細胞氧化應(yīng)激損傷模型的建立。用H_2O_2誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的原代心肌細胞損傷。實驗分正常對照組(normal control)，H_2O_2損傷組(H_2O_2group,濃度分別為10、30、50、100、200μmol/L，作用時間為6h、12h、24h）。通過MTT比色法檢測各組細胞活力，摸索H_2O_2誘導(dǎo)心肌細胞氧化損傷的適當(dāng)濃度及時間。根據(jù)MTT摸索的心肌細胞氧化應(yīng)激損傷模型的時間與濃度，實驗分正常對照組(normal control)，H_2O_2損傷組(H_2O_2group,濃度分別為30、50、100、200μmol/L，作用時間為6h）。消化、離心收集細胞，Annexin V-FITC和PI染色15min后用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。進一步確定H_2O_2濃度，建立心肌細胞H_2O_2氧化應(yīng)激損傷模型。 3H_2O_2干預(yù)心肌細胞后觀察miRNA-214表達變化。培養(yǎng)的大鼠心肌細胞給予H_2O_2，分空白對照組和H_2O_2干預(yù)組（濃度分別為30、50、100μmol/L)干預(yù)6h后提取細胞中的RNA，用qRT-PCR檢測miRNA-214的相對表達變化。 4AnnexinV/PI方法檢測不同轉(zhuǎn)染組的心肌細胞經(jīng)H_2O_2誘導(dǎo)損傷后的細胞凋亡率變化。原代心肌細胞經(jīng)72h培養(yǎng)并用轉(zhuǎn)染的方法上調(diào)或下調(diào)miRNA-214的表達分為正常細胞組，及不同轉(zhuǎn)染組（miRNA-214前體組、miRNA-214前體空白組、miRNA-214抑制劑組、miRNA-214抑制劑空白組）后各組都用H_2O_2（100μmol/L）誘導(dǎo)6h后用AnnexinV/PI染色細胞上流式細胞儀檢測不同轉(zhuǎn)染組的心肌細胞經(jīng)H_2O_2誘導(dǎo)后的凋亡率。 5Western blot檢測不同干預(yù)組PTEN的蛋白表達變化培養(yǎng)細胞分為正常對照組和H_2O_2（100μmol/L）干預(yù)組以及不同轉(zhuǎn)染組（miRNA-214前體組、miRNA-214前體空白組、miRNA-214抑制劑組），分別提取各組蛋白進行蛋白定量檢測。 結(jié)果： 1H_2O_2對心肌細胞有損傷作用MTT檢測結(jié)果提示，隨著H_2O_2濃度的升高，作用時間的延長，細胞活力（OD值）逐漸降低，呈明顯的劑量和時間依賴性。AnnexinV/PI方法檢測隨著H_2O_2濃度的升高，細胞凋亡率逐漸增加，呈明顯的劑量依賴性，說明H_2O_2可誘導(dǎo)心肌細胞損傷。我們選擇引起細胞凋亡30%左右的H_2O_2濃度（100μmol/L）作用6h，建立氧化應(yīng)激損傷模型。 2氧化應(yīng)激損傷后的心肌細胞中miRNA-214的表達有變化RT-PCR檢測到心肌細胞中miRNA-214的相對表達變化具有H_2O_2濃度依賴性。H_2O_2干預(yù)各組之間都有統(tǒng)計學(xué)差異（P0.05)。 3miRNA-214對H_2O_2誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡有保護作用。流式結(jié)果表明H_2O_2100μmol/L誘導(dǎo)心肌細胞損傷6h后的miRNA-214前體組細胞凋亡率較正常細胞及miRNA-214抑制劑組都低，抑制劑組細胞凋亡率明顯高于正常組和前體組均有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05)，而前體空白對照組、抑制劑空白對照組與未轉(zhuǎn)染組相比凋亡率變化不大無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05）。說明miRNA-214對H_2O_2誘導(dǎo)損傷的心肌細胞有保護作用。 4PTEN是miRNA-214保護心肌細胞凋亡的作用靶基因。抑制了PTEN蛋白活性后，發(fā)現(xiàn)上調(diào)與下調(diào)miRNA-214表達變化對氧化應(yīng)激損傷的心肌細胞凋亡率影響無差別。Western blot檢測到經(jīng)pre-miRNA-214轉(zhuǎn)染后的心肌細胞中PTEN的蛋白表達量下降，而經(jīng)轉(zhuǎn)染anti-miRNA-214的細胞中PTEN的蛋白表達量增加，均與對照組有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論： 1H_2O_2誘導(dǎo)的心肌細胞氧化應(yīng)激損傷中miRNA-214的表達有變化且具有H_2O_2濃度依賴性。正常細胞、H2O（230、50、100μmol/L）其miRNA-214的表達隨濃度增加而上升。 2miRNA-214對H_2O_2誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡有保護作用。miRNA-214表達上調(diào)可降低心肌細胞凋亡率，表達下調(diào)可增加心肌細胞凋亡。 3PTEN是miRNA-214在調(diào)節(jié)心肌細胞凋亡中的靶基因。PTEN的表達量受miRNA-214的調(diào)節(jié)，miRNA-214上調(diào)后PTEN表達下降，miRNA-214下調(diào)后PTEN的表達增加，抑制PTEN活性后miRNA-214對心肌細胞凋亡的保護作用變得不明顯。
【關(guān)鍵詞】：microRNA-214 心肌細胞 H_2O_2 細胞凋亡 PTEN 細胞損傷
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R363
【目錄】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-12
• 前言12
• 材料與方法12-26
• 結(jié)果26-30
• 附圖30-38
• 附表38-41
• 討論41-45
• 結(jié)論45
• 參考文獻45-49
• 綜述 微小 RNA 在心肌肥大中的作用及機制49-56
• 參考文獻53-56
• 致謝56-57
• 個人簡歷57

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 關(guān)欣;李應(yīng)東;馬海彥;劉凱;;新生大鼠心肌細胞原代培養(yǎng)分離方法的改進[J];中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志;2009年01期

2 吳揚;耿鵬;王玉琴;劉艷;;MicroRNA-1在心肌肥大中對L-型鈣通道β_2亞基的負性調(diào)控作用[J];中國應(yīng)用生理學(xué)雜志;2012年04期

本文編號：568139