本文關(guān)鍵詞：日本血吸蟲重組Bb（pGEX-Sj26GST-Sj32）疫苗的構(gòu)建及免疫應(yīng)答的動態(tài)觀察

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【摘要】：目的 日本血吸蟲病是由日本血吸蟲（Schistosoma japonicum, Sj）引起的一種危害人體健康的地方性人獸共患寄生蟲病。由于該病危害大，因此研發(fā)有效的疫苗防治該病已是勢在必行。本研究擬構(gòu)建Sj重組兩歧雙歧桿菌(Bifidobacterium bifidum，Bb)(pGEX-Sj26GST-Sj32)疫苗，并研究其免疫BALB/c小鼠后免疫應(yīng)答的動態(tài)變化，以期為Sj的免疫預(yù)防提供一條新途徑。 方法 從我室保存的BL21(DE3)(pET28α-Sj26GST-Sj32)重組菌中抽提質(zhì)粒pET28α-Sj26GST-Sj32，PCR擴(kuò)增Sj26GST-Sj32融合基因，將該融合基因定向克隆到大腸埃希菌-雙歧桿菌穿梭表達(dá)載體pGEX-1λT中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-Sj26GST-Sj32。將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中，抽提質(zhì)粒并進(jìn)行雙酶切，鑒定載體片段及目的基因片段長度。用電穿孔法將重組質(zhì)粒pGEX-Sj26GST-Sj32轉(zhuǎn)化至Bb，構(gòu)建Bb(pGEX-Sj26GST-Sj32)疫苗，抽提質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后以SDS-PAGE及Western-blot對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。 將96只BALB/c小鼠隨機(jī)分為2組，每組48只，用重組Bb(pGEX-Sj26GST-Sj32)疫苗分別經(jīng)口服灌胃和鼻腔粘膜兩種途徑免疫小鼠，在免疫后0～22周每兩周兩組分別剖殺4只小鼠，分離血清，ELISA法測定血清抗體及細(xì)胞因子；取脾并分離脾細(xì)胞，用Sj成蟲抗原（SjAWA抗原）和刀豆蛋白A（ConA）刺激培養(yǎng)，四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT法)檢測免疫小鼠脾細(xì)胞增殖反應(yīng)，同時設(shè)原液組對照；用流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測免疫小鼠脾CD4+和CD8+T細(xì)胞亞群的百分比；脾細(xì)胞經(jīng)SjAWA抗原及ConA刺激培養(yǎng)，收集培養(yǎng)的上清液，雙抗體夾心ELISA法檢測脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液的IL-10及IL-12水平，，設(shè)原液組（stock group）作為對照；脾細(xì)胞經(jīng)ConA培養(yǎng)，流式細(xì)胞儀檢測脾細(xì)胞的凋亡發(fā)生率，并設(shè)原液組作為對照。 結(jié)果 PCR成功擴(kuò)增出長度為1991bp的Sj26GST-Sj32融合基因；雙酶切證實Sj26GST-Sj32融合基因成功插入質(zhì)粒pGEX-1λT中；PCR證實從重組Bb(pGEX-Sj26GST-Sj32)疫苗中擴(kuò)增出1991bp的Sj26GST-Sj32融合基因；SDS-PAGE分析顯示將重組質(zhì)粒pGEX-Sj26GST-Sj32在E.coli BL21中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，得到分子量約85kDa的條帶，其中以5～7h處表達(dá)水平較高； Western-blot發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒pGEX-Sj26GST-Sj32表達(dá)產(chǎn)物可被Sj感染的兔血清識別。 口服免疫（per os，PO）組小鼠血清IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgE和IgA水平分別在免疫后6、8、8、4、6、12和6周達(dá)峰值；血清IL-10和IL-12水平分別在免疫后12、6周達(dá)峰值。鼻腔粘膜（intranasal，IN）組小鼠血清IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgE和IgA水平分別在免疫后4、2、6、2、4、8和8周達(dá)峰值；血清IL-10和IL-12水平分別于免疫后6周達(dá)峰值。PO組增殖水平于免疫后4w達(dá)高峰，而IN組于免疫后12w達(dá)高峰。PO組脾CD4+T細(xì)胞亞群于免疫后4w達(dá)最高水平，IN組CD4+T細(xì)胞亞群于免疫后12w達(dá)最高水平；PO組脾CD8+T細(xì)胞亞群于10w達(dá)峰值，IN組CD8+T細(xì)胞亞群于免疫后6w達(dá)最高水平。PO組和IN組小鼠脾細(xì)胞IL-10水平均于免疫后6w達(dá)最高；PO組小鼠脾細(xì)胞IL-12水平于免疫后6w達(dá)最高，IN組脾細(xì)胞IL-12水平于12w達(dá)最高水平。PO組小鼠脾細(xì)胞凋亡率于免疫后6w達(dá)最高，而IN組脾細(xì)胞凋亡率于12w達(dá)最高水平。 結(jié)論 成功構(gòu)建日本血吸蟲重組Bb(pGEX-Sj26GST-Sj32)疫苗；該疫苗在免疫早期可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生有效地Th1和Th2型混合性免疫應(yīng)答。
【關(guān)鍵詞】：日本血吸蟲 重組Bb(pGEX-Sj26GST-Sj32)疫苗 構(gòu)建 免疫應(yīng)答 動態(tài)觀察
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R392
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對照6-8
• 中文摘要8-11
• 英文摘要11-15
• 前言15-18
• 參考文獻(xiàn)17-18
• 第一章 日本血吸蟲重組 Bb(pGEX-Sj26GST-Sj32)疫苗構(gòu)建及其表達(dá)效率18-32
• 第一節(jié) 日本血吸蟲重組 Bb(pGEX-Sj26GST-Sj32)疫苗的構(gòu)建及鑒定18-27
• 1 材料與方法18-21
• 2 結(jié)果21-23
• 3 討論23-25
• 參考文獻(xiàn)25-27
• 第二節(jié) 日本血吸蟲重組質(zhì)粒 pGEX-Sj26GST-Sj32 在大腸埃希菌 BL21(DE3)表達(dá)效率的研究27-32
• 1 材料和方法27-28
• 2 結(jié)果28-30
• 3 討論30
• 參考文獻(xiàn)30-32
• 第二章 日本血吸蟲重組Bb(pGEX-Sj26GST-Sj32)疫苗誘導(dǎo)BALB/c鼠免疫應(yīng)答的動態(tài)觀察32-62
• 第一節(jié) 日本血吸蟲重組Bb(pGEX-Sj26GST-Sj32)疫苗免疫BALB/c鼠血清抗體及細(xì)胞因子的動態(tài)觀察32-42
• 1 材料與方法32-33
• 2 結(jié)果33-36
• 3 討論36-39
• 參考文獻(xiàn)39-42
• 第二節(jié) 日本血吸蟲重組 Bb(pGEX-Sj26GST-Sj32)疫苗免疫小鼠后脾細(xì)胞增殖的動態(tài)觀察42-47
• 1 材料與方法42-43
• 2 結(jié)果43-45
• 3 討論45
• 參考文獻(xiàn)45-47
• 第三節(jié) 日本血吸蟲重組 Bb(pGEX-Sj26GST-Sj32)疫苗免疫小鼠后脾細(xì)胞亞群的動態(tài)觀察47-52
• 1 材料與方法47-48
• 2 結(jié)果48-49
• 3 討論49-51
• 參考文獻(xiàn)51-52
• 第四節(jié) 日本血吸蟲重組 Bb(pGEX-Sj26GST-Sj32)疫苗免疫小鼠后脾細(xì)胞因子動態(tài)觀察52-57
• 1 材料與方法52-53
• 2 結(jié)果53-55
• 3 討論55-56
• 參考文獻(xiàn)56-57
• 第五節(jié) 日本血吸蟲重組 Bb(pGEX-Sj26GST-Sj32)疫苗免疫小鼠后脾細(xì)胞凋亡的動態(tài)觀察57-62
• 1 材料與方法57-58
• 2 結(jié)果58-59
• 3 討論59-60
• 參考文獻(xiàn)60-62
• 全文小結(jié)62-63
• 文獻(xiàn)綜述63-71
• 參考文獻(xiàn)68-71
• 致謝71-72
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文72-73

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 李文桂;陳雅棠;;雙歧桿菌生物學(xué)作用研究進(jìn)展[J];地方病通報;2006年01期

2 郭志英,易成,王樹人,王浩毅;嬰兒雙歧桿菌/胞嘧啶脫氨酶腫瘤靶向性基因治療系統(tǒng)的構(gòu)建[J];中國肺癌雜志;2004年02期

3 李永,曾憲芳,易新元,田明禮;應(yīng)用日本血吸蟲病患者血清特異性抗體亞類考核療效[J];湖南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;1997年05期

4 蔡春,易新元,曾憲芳,周金春,舒新華;重組日本血吸蟲SjGST-Sj32蛋白誘導(dǎo)小鼠保護(hù)性免疫的研究[J];湖南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;1999年03期

5 王昌源,陳雅棠,余登高,黃愛龍;多房棘球絳蟲ELP重組蛋白疫苗免疫Balb/c小鼠引起的免疫應(yīng)答[J];免疫學(xué)雜志;2003年04期

6 陳欲曉;細(xì)胞因子對血吸蟲病免疫調(diào)節(jié)的研究進(jìn)展[J];中國熱帶醫(yī)學(xué);2004年02期

7 田芳,夏超明,駱偉,龔唯,周衛(wèi)芳;協(xié)同刺激分子B7-1/2對日本血吸蟲感染小鼠Th1/Th2細(xì)胞因子表達(dá)水平的影響[J];熱帶醫(yī)學(xué)雜志;2003年02期

8 趙晶晶;黃俊;麥t熡

本文編號：568079