本文關(guān)鍵詞：Th17細胞在蛔蟲抗原誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡作用機制的探討

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【摘要】：目的： 探討Th17細胞在蛔蟲抗原誘導(dǎo)的人肺腺癌細胞（A549）凋亡中的作用機制。 方法： 1、蛔蟲抗原誘導(dǎo)細胞凋亡 （1）蛔蟲抗原的制備：將人蛔蟲蟲體制成勻漿，經(jīng)10,000rpm離心30min，去除組織糜沉淀及大分子蛋白，取上清過0.4μm濾膜除菌，用核酸/蛋白分析儀檢測其蛋白濃度，并排除內(nèi)毒素污染后，分裝后置-30℃凍存?zhèn)溆谩?（2）腫瘤細胞株的培養(yǎng)：A549細胞常規(guī)復(fù)蘇后，用含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度至1×105/ml，置37℃，5％CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞至對數(shù)生長期時用0.25%的胰蛋白酶消化傳代。 （3）細胞活性檢測：取對數(shù)生長期A549細胞，經(jīng)0.25%的胰蛋白酶消化后制成細胞懸液，加入96孔板，每孔10,000個細胞，置37℃，5％CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h，然后加入不同濃度蛔蟲抗原分別培養(yǎng)18h和24h，加入10μlCCK-8,培養(yǎng)2-3h，酶標(biāo)儀檢測OD450值。根據(jù)OD450值確定抗原作用濃度及時間。 2、細胞凋亡和周期的檢測 （1）T細胞制備和鑒定：取健康人全血用淋巴細胞分離液分離，吸取淋巴細胞層后用無血清RPMI1640洗滌2次，用含5%FBS的RPMI1640重懸細胞，過尼龍毛柱。過尼龍毛柱后的細胞加入相對應(yīng)量的anti-CD3FITC、anti-CD4APC、anti-CD8PE、anti-CD45PerCP避光孵育15min，，流式檢測T細胞純度，CD3、CD4以及CD3+CD8+表達為T細胞。 （2）細胞凋亡率檢測：A549細胞組和A549細胞+T細胞共培養(yǎng)組培養(yǎng)4h后，加入不同濃度的蛔蟲抗原（25μg/ml、125μg/ml、500μg/ml）分別作用1h、18h、24h后收集細胞。用4℃預(yù)冷磷酸鹽緩沖液洗滌2次，加入1.25μl AnnexinV-FITC，常溫避光孵育15min后離心，加入PI10μl,上流式細胞儀檢測。 （3）細胞周期檢測：細胞培養(yǎng)4h后，加入125μg/ml的蛔蟲抗原與A549細胞作用18h后，收集細胞，預(yù)冷磷酸鹽緩沖液洗滌2次，70%乙醇4℃固定過夜，加入300μl配制備好的染液避光孵育30min，上流式細胞儀檢測。 3.細胞因子表達的檢測 （1）實驗分組：實驗分為5組，分別為組①：A549細胞+培養(yǎng)基；組②：A549細胞+T細胞；組③：A549細胞+蛔蟲抗原；組④：蛔蟲抗原+T細胞；組⑤：A549細胞+蛔蟲抗原+T細胞�；紫x抗原分別設(shè)定低、中、高三個劑量濃度。 （2）Transwell小室共培養(yǎng)：組②A549細胞+T細胞和組⑤A549細胞+蛔蟲抗原+T細胞采用Transwell小室共培養(yǎng)體系，將上室加入T細胞下室加入A549細胞T細胞、A549細胞密度比為15:1。使細胞之間自身并不接觸，而細胞之間的影響只通過細胞因子之間的傳遞。 （3）ELISA檢測細胞因子：收集各實驗組細胞上清，使用ELISA試劑盒檢測細胞因子IL-6、IL-17、IL-23和TGF-β。 （4）熒光定量PCR：分別提取各組細胞的總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNAs，用Applied Biosystems7500Real-Time PCR System檢測cDNAs特異性引物IL-6、IL-17、IL-23和TGF-β mRNA表達。用SYBR Premix Ex Taq I kit檢測目的產(chǎn)物，實時PCR反應(yīng)體系為：95℃、30S；（95℃、5S；60℃、34S）×40個循環(huán)95℃、15S；60℃、1min；95℃、15S。計算相對表達值。 4.數(shù)據(jù)處理 統(tǒng)計學(xué)分析：采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行分析。獨立實驗的數(shù)據(jù)采用Mean±SD表示，小樣本數(shù)據(jù)采用Lg10轉(zhuǎn)換，實驗組與對照組的組間差異比較采用one-way ANOVA與t檢驗分析，P0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果： 1、細胞毒性檢測：取細胞存活率大于50％為誘導(dǎo)實驗的濃度�；紫x抗原濃度為125μg/ml時，細胞抑制率34%，為所有作用濃度最高，且與陰性對照組比較有顯著性差異（P0.01）。故取蛔蟲抗原低、中、高濃度分別為25μg/ml、125μg/ml、500μg/ml。 2、細胞凋亡率檢測：蛔蟲抗原125μg/ml濃度處理組在18h時，細胞早期凋亡率（37.801.70）%顯著高于對照組（7.250.50）%；而與T淋巴細胞共培養(yǎng)的蛔蟲抗原125μg/ml濃度處理組在18h時，細胞早期凋亡率則由（37.801.70）%下降到（7.200.57）%。 3、A549細胞周期檢測：蛔蟲抗原125μg/ml濃度處理組在18h時，細胞周期G1/S占8.18，顯著高于陰性對照G1/S的4.57。 4、細胞因子表達檢測： 1) ELISA檢測：在同一時間段內(nèi)，當(dāng)蛔蟲抗原濃度增加時，除TGF-β外，其他細胞因子的表達水平都隨著濃度的增加而升高，且都有顯著性差異（P0.05）。在同一濃度下，除TGF-β外，其他細胞因子的表達水平都隨著蛔蟲抗原作用時間的延長而降低，存在顯著性差異（P0.05）。TGF-β則在各時間段和各濃度區(qū)間內(nèi)無明顯趨勢。 2)熒光定量PCR：各實驗組A549細胞的IL-6、IL-17和TGF-β mRNA水平都在18h達到高峰，且都與空白對照組存在差異性（P0.05）。各實驗組T淋巴細胞的IL-6、IL-17、IL-23和TGF-β mRNA水平也在同一作用時間段達到最高，且與對照組存在差異性（P0.05）。 結(jié)論： 1.蛔蟲抗原誘導(dǎo)A549細胞凋亡阻滯在G1期。 2.蛔蟲抗原能夠刺激T細胞IL-17和IL-23表達水平增高使Th17活化。 3.蛔蟲抗原誘導(dǎo)的A549細胞凋亡與Th17細胞的分化有關(guān)。 4.隨著蛔蟲抗原作用時間延長TGF-β表達無明顯趨勢，而IL-6升高，IL-17和IL-23表達水平降低，導(dǎo)致Th17細胞的分化受阻，細胞凋亡被抑制。
【關(guān)鍵詞】：蛔蟲抗原 T淋巴細胞 Th17細胞 A549細胞 凋亡 IL-6 IL-17 IL-23 TGF-β
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R329.2
【目錄】：

• 摘要3-6
• ABSTRACT6-12
• 中英文縮寫一覽表12-13
• 第1章 引言13-16
• 1.1 感染和腫瘤與細胞因子的關(guān)系13-14
• 1.2 Th17 細胞的特性及研究進展14-16
• 第2章 材料與方法16-27
• 2.1 實驗動物、試劑與設(shè)備16-18
• 2.1.1 實驗動物及細胞株16
• 2.1.2 主要的實驗試劑16
• 2.1.3 主要的實驗設(shè)備16-17
• 2.1.4 主要的試劑配制17-18
• 2.2 實驗方法18-27
• 2.2.1 蛔蟲抗原的制備18
• 2.2.2 體外培養(yǎng)腫瘤細胞株18
• 2.2.3 實驗分組18
• 2.2.4 Transwell 培養(yǎng)18
• 2.2.5 CCK8 檢測18-19
• 2.2.6 T 淋巴細胞制備19
• 2.2.7 T 淋巴細胞的鑒定19-20
• 2.2.8 細胞凋亡率的檢測20
• 2.2.9 FCM 檢測細胞周期20-21
• 2.2.10 ELISA 法檢測細胞因子21-22
• 2.2.11 熒光定量 PCR 分析 IL-6、TGF-β、IL-17 和 IL-23 mRNA 的相對表達水平22-26
• 2.2.12 統(tǒng)計學(xué)分析26-27
• 第3章 結(jié)果27-40
• 3.1 蛔蟲抗原的制備27
• 3.2 細胞毒性檢測27
• 3.3 FCM 法檢測 T 淋巴細胞表面分子的表達27-28
• 3.4 FCM 檢測蛔蟲抗原對 A549 細胞凋亡的影響28-29
• 3.5 FCM 檢測蛔蟲抗原對 A549 細胞周期的影響29
• 3.6 ELISA 檢測 Th17 細胞相關(guān)細胞因子表達29-35
• 3.6.1 ELISA 檢測 IL-6 表達水平變化29-31
• 3.6.2 ELISA 檢測 TGF-β表達水平變化31-32
• 3.6.3 ELISA 檢測 IL-17 表達水平變化32-34
• 3.6.4 ELISA 檢測 IL-23 表達水平變化34-35
• 3.7 熒光定量 PCR 分析 IL-6、TGF-β、IL-17 和 IL-23 mRNA 的相對表達水平35-40
• 3.7.1 熒光定量 PCR 分析 IL-6 mRNA 的相對表達水平水平變化36-37
• 3.7.2 熒光定量 PCR 分析 TGF-β mRNA 的相對表達水平水平變化37-38
• 3.7.3 熒光定量 PCR 分析 IL-17 mRNA 的相對表達水平水平變化38-39
• 3.7.4 熒光定量 PCR 分析 IL-23 mRNA 的相對表達水平水平變化39-40
• 第4章 討論40-46
• 4.1 Th17 細胞與蛔蟲抗原誘導(dǎo) A549 細胞凋亡40-41
• 4.2 蛔蟲抗原對 A549 細胞周期的影響41
• 4.3 炎性細胞因子 IL-6 和 TGF-β的表達水平41-43
• 4.4 Th17 細胞相關(guān)細胞因子 IL-17 和 IL-23 的表達水平43-46
• 第5章 結(jié)論46-47
• 致謝47-48
• 參考文獻48-51
• 附錄51-53
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果53-54
• 綜述54-59
• 參考文獻57-59

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 田晶;巴彩鳳;;小鼠感染豬附紅細胞體后Th17相關(guān)因子的實驗研究[J];中國人獸共患病學(xué)報;2011年03期

2 祝偉;黃川;黃艷琴;胡銀英;戴志芳;袁芳;袁鏗;;負(fù)載人蛔蟲和豬蛔蟲抗原樹突狀細胞影響T細胞亞群活性研究[J];中國人獸共患病學(xué)報;2013年08期

本文編號：553686