本文關(guān)鍵詞：新型IRE1α-XBP1通路小分子調(diào)節(jié)劑的發(fā)現(xiàn)與作用機制研究

  更多相關(guān)文章： 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 未折疊蛋白應(yīng)答 IRE1α/XBP1 ROS 2-DG

【摘要】：由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ER stress)引發(fā)的未折疊蛋白應(yīng)答(unfolded protein response, UPR)與許多疾病密切相關(guān)。IRE la (Inositol-requiring transmembrane kinase/endonuclease-1)在UPR感受器中最保守,其功能是通過核酸內(nèi)切酶活性將底物XBP1(X-box binding protein-1) mRNA剪切后,形成有活性的轉(zhuǎn)錄因子XBP1s進入細胞核中啟動其下游基因緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。研究表明IRE1a-XBP1在多種疾病中處于激活狀態(tài),包括癌癥、糖尿病、肥胖、亨廷頓綜合癥等。因此尋找IRE1a的調(diào)節(jié)劑對IRE1a-XBP1信號通路的調(diào)控機制以及相關(guān)疾病的治療具有重要意義。 我們通過XBP1-DBD-luc細胞模型對438個化合物進行篩選,得到28個UPR調(diào)節(jié)劑,并且利用優(yōu)化的IRE1a核酸酶分子模型評價得到個7個IRE1a核酸酶抑制劑。隨后采用RT-PCR方法確定化合物對XBP1剪切的影響,以及對UPR其他相關(guān)指針基因GRP78和CHOP mRNA水平的影響,進一步確定化合物在細胞水平對IRE1a-XBP1通路調(diào)節(jié)的特異性與選擇性。 我們發(fā)現(xiàn)化合物21#在分子水平可直接抑制IRE1a核酸酶活性,其IC50為340nM,且不抑制RNase A活性,表明其對IRE1a核酸酶的抑制作用具有選擇性。目前已知的IRE1a核酸酶直接抑制劑是通過與IRE1a核酸酶的907位賴氨酸發(fā)生共價結(jié)合而抑制酶活。我們發(fā)現(xiàn)21#分子水平與DTT反應(yīng)產(chǎn)生ROS而抑制IRE1a酶活性,提示21#抑制IRE1a酶活的作用可能與ROS有關(guān),提示我們IREla酶活性可能被氧化應(yīng)激所調(diào)控,但H2O2和zhang400-l對IREla核酸酶活影響很弱,進一步提示我們21#抑制IRE1a核酸酶活性與其化學結(jié)構(gòu)有關(guān)。在細胞水平上,21#在10μ,M濃度下完全抑制1μg/mL衣霉素誘導的XBP1剪切,但對GRP78和CHOP基因表達調(diào)控沒有明顯作用,表明21#對IRE1a-XBP1通路的抑制具有選擇性。 另外我們發(fā)現(xiàn)化合物17#可抑制TM和2-DG誘導的GRP78和CHOP mRNA水平的上調(diào),是個廣譜UPR抑制劑。2-DG是葡萄糖類似物,具有一定抗腫瘤效應(yīng),但效果不佳。17#可抑制由2-DG (2-Deoxy-D-Glucose)誘導的UPR相關(guān)因子的上調(diào),可同2-DG共同作用引起Hela細胞周期阻滯,增強對細胞增殖的抑制作用。在Hela細胞中過表達GRP78可部分逆轉(zhuǎn)2-DG與17#共同作用引起的細胞周期阻滯,提示2-DG激活UPR可能是抗腫瘤效果不佳的原因。 綜上所述,通過XBP1-DBD-luc細胞模型和IREla核酸酶分子測活模型得到化合物21#和17#。對21#抑制IRE1a酶活特異性和選擇性的機制進行研究,并確定ROS對IRE1a酶活性的抑制作用有貢獻,初步提出IREla核酸酶抑制劑的新機制,為新型IRE1a核酸酶小分子抑制劑提供新的條件和思路；其次,UPR廣譜抑制劑17#,可增強2-DG對腫瘤細胞生長的抑制作用,為2-DG抗腫瘤的深入和完善打下基礎(chǔ),也為UPR廣譜抑制劑的篩選提供新的思路。
【關(guān)鍵詞】：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 未折疊蛋白應(yīng)答 IRE1α/XBP1 ROS 2-DG
【學位授予單位】：華東師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R363
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-13
• 第一章 前言13-30
• 1.1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激13-14
• 1.2 IRE1α—最保守的UPR感受器14-16
• 1.3 IRE1α-XBP1與疾病16-23
• 1.3.1 IRE1α-XBP1與腫瘤16-21
• 1.3.2 IRE1α-XBP1與代謝疾病21
• 1.3.3 IRE1α-XBP1其他一些相關(guān)疾病21-23
• 1.4 IRE1-XBP1通路調(diào)節(jié)劑的研究現(xiàn)狀23-25
• 1.4.1 IRE1α-XBP1抑制劑23-24
• 1.4.2 IRE1α-XBP1激活劑24-25
• 1.5 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與氧化應(yīng)激25-27
• 1.6 IRE1α-XBP1反應(yīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)27-28
• 1.7 論文研究目的與總體設(shè)計28-30
• 第二章 基于IRE1α-XBP1通路調(diào)節(jié)劑的篩選以及小分子化合物21#和17#的發(fā)現(xiàn)30-44
• 1 實驗材料30-32
• 2 實驗方法32-37
• 2.1 IRE1α核酸酶底物的設(shè)計32-33
• 2.2 IRE1α核酸酶活性測定體系及注意事項33-34
• 2.3 細胞培養(yǎng)34
• 2.4 細胞水平化合物篩選步驟34-35
• 2.5 RNase A測活體系35
• 2.6 Luciferase酶活測定35
• 2.7 RT-PCR35-37
• 2.8 實時熒光定量PCR(Q-PCR)37
• 2.9 數(shù)據(jù)處理與系統(tǒng)指標37
• 3 實驗結(jié)果37-42
• 3.1 細胞水平篩選獲得28個UPR小分子調(diào)節(jié)劑37-38
• 3.1.1 初篩37-38
• 3.1.2 復(fù)篩38
• 3.2 評價候選化合物分子水平對IRE1α核酸酶活性及細胞水平對XBP1剪切的影響38-41
• 3.2.1 候選化合物分子水平對IRE1α核酸酶活性的影響38-40
• 3.2.2 RT-PCR評價候選化合物在細胞水平對XBP1剪切的影響40-41
• 3.3 分子和細胞水平考察化合物作用的選擇性41-42
• 3.3.1 IRE1α核酸酶抑制劑對RNase A活性的影響41
• 3.3.2 細胞水平評價28個有效化合物對IRE1α-XBP1通路影響的選擇性41-42
• 4 討論與總結(jié)42-44
• 第三章 21#抑制IRE1α核酸酶活性的作用機制研究44-59
• 1 實驗材料44
• 2 實驗方法44-47
• 2.1 IRE1α激酶分子測活方法(HTRF)介紹44-45
• 2.2 激酶測活體系45-46
• 2.3 IRE1α核酸酶活性測定46
• 2.4 ROS檢測46
• 2.5 細胞培養(yǎng)46
• 2.6 RT-PCR和western blot46-47
• 2.7 數(shù)據(jù)處理與系統(tǒng)指標47
• 3 實驗結(jié)果47-56
• 3.1 星形孢菌素(STS)對IRE1α激酶活性的影響47
• 3.2 細胞水平21#對IRE1α酶活性的影響47-48
• 3.3 分子水平21#對IRE1α激酶活性的影響48-49
• 3.4 21#對IRE1α酶活性的抑制與孵育時間的關(guān)系49-50
• 3.5 DTT不同濃度對21#發(fā)揮酶活抑制作用的影響50-52
• 3.6 檢測DTT與21#反應(yīng)是否產(chǎn)生活性氧(ROS)52-53
• 3.7 檢測ROS部分清除后21#對IRE1α核酸酶活性的影響53-54
• 3.8 H_2O_2和zhang400-1對IRE1α酶活性的影響54-56
• 3.9 質(zhì)譜鑒定IRE1α可被氧化的保守半胱氨酸位點56
• 4 討論與總結(jié)56-59
• 第四章 IRE1α-XBP1非選擇性抑制劑17#及其改造系列化合物的抗腫瘤活性與作用機制研究59-71
• 1 實驗材料60
• 2 實驗方法60-62
• 2.1 RT-PCR,western blot,Q-PCR60-61
• 2.2 MTS法檢測細胞活率61
• 2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡和細胞周期61-62
• 2.4 數(shù)據(jù)處理與系統(tǒng)指標62
• 3 實驗結(jié)果62-69
• 3.1 17#對UPR下游因子轉(zhuǎn)錄水平的影響62-64
• 3.2 17#與2-DG共同作用抑制腫瘤細胞生長64-65
• 3.3 17#與2-DG共同作用引起細胞周期阻滯65-66
• 3.4 17#與2-DG的共同作用效應(yīng)與UPR相關(guān)66-67
• 3.5 17#及其改造化合物的相關(guān)評價67-69
• 4 總結(jié)及待解決的問題69-71
• 參考文獻71-75
• 附錄75-76
• 縮略語檢索表76-78
• 致謝78-79

【共引文獻】

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本文編號：544410