本文關(guān)鍵詞：新型IRE1α-XBP1通路小分子調(diào)節(jié)劑的發(fā)現(xiàn)與作用機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 未折疊蛋白應(yīng)答 IRE1α/XBP1 ROS 2-DG

【摘要】：由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ER stress)引發(fā)的未折疊蛋白應(yīng)答(unfolded protein response, UPR)與許多疾病密切相關(guān)。IRE la (Inositol-requiring transmembrane kinase/endonuclease-1)在UPR感受器中最保守,其功能是通過核酸內(nèi)切酶活性將底物XBP1(X-box binding protein-1) mRNA剪切后,形成有活性的轉(zhuǎn)錄因子XBP1s進(jìn)入細(xì)胞核中啟動(dòng)其下游基因緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。研究表明IRE1a-XBP1在多種疾病中處于激活狀態(tài),包括癌癥、糖尿病、肥胖、亨廷頓綜合癥等。因此尋找IRE1a的調(diào)節(jié)劑對(duì)IRE1a-XBP1信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制以及相關(guān)疾病的治療具有重要意義。 我們通過XBP1-DBD-luc細(xì)胞模型對(duì)438個(gè)化合物進(jìn)行篩選,得到28個(gè)UPR調(diào)節(jié)劑,并且利用優(yōu)化的IRE1a核酸酶分子模型評(píng)價(jià)得到個(gè)7個(gè)IRE1a核酸酶抑制劑。隨后采用RT-PCR方法確定化合物對(duì)XBP1剪切的影響,以及對(duì)UPR其他相關(guān)指針基因GRP78和CHOP mRNA水平的影響,進(jìn)一步確定化合物在細(xì)胞水平對(duì)IRE1a-XBP1通路調(diào)節(jié)的特異性與選擇性。 我們發(fā)現(xiàn)化合物21#在分子水平可直接抑制IRE1a核酸酶活性,其IC50為340nM,且不抑制RNase A活性,表明其對(duì)IRE1a核酸酶的抑制作用具有選擇性。目前已知的IRE1a核酸酶直接抑制劑是通過與IRE1a核酸酶的907位賴氨酸發(fā)生共價(jià)結(jié)合而抑制酶活。我們發(fā)現(xiàn)21#分子水平與DTT反應(yīng)產(chǎn)生ROS而抑制IRE1a酶活性,提示21#抑制IRE1a酶活的作用可能與ROS有關(guān),提示我們IREla酶活性可能被氧化應(yīng)激所調(diào)控,但H2O2和zhang400-l對(duì)IREla核酸酶活影響很弱,進(jìn)一步提示我們21#抑制IRE1a核酸酶活性與其化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)。在細(xì)胞水平上,21#在10μ,M濃度下完全抑制1μg/mL衣霉素誘導(dǎo)的XBP1剪切,但對(duì)GRP78和CHOP基因表達(dá)調(diào)控沒有明顯作用,表明21#對(duì)IRE1a-XBP1通路的抑制具有選擇性。 另外我們發(fā)現(xiàn)化合物17#可抑制TM和2-DG誘導(dǎo)的GRP78和CHOP mRNA水平的上調(diào),是個(gè)廣譜UPR抑制劑。2-DG是葡萄糖類似物,具有一定抗腫瘤效應(yīng),但效果不佳。17#可抑制由2-DG (2-Deoxy-D-Glucose)誘導(dǎo)的UPR相關(guān)因子的上調(diào),可同2-DG共同作用引起Hela細(xì)胞周期阻滯,增強(qiáng)對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用。在Hela細(xì)胞中過表達(dá)GRP78可部分逆轉(zhuǎn)2-DG與17#共同作用引起的細(xì)胞周期阻滯,提示2-DG激活UPR可能是抗腫瘤效果不佳的原因。 綜上所述,通過XBP1-DBD-luc細(xì)胞模型和IREla核酸酶分子測(cè)活模型得到化合物21#和17#。對(duì)21#抑制IRE1a酶活特異性和選擇性的機(jī)制進(jìn)行研究,并確定ROS對(duì)IRE1a酶活性的抑制作用有貢獻(xiàn),初步提出IREla核酸酶抑制劑的新機(jī)制,為新型IRE1a核酸酶小分子抑制劑提供新的條件和思路；其次,UPR廣譜抑制劑17#,可增強(qiáng)2-DG對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用,為2-DG抗腫瘤的深入和完善打下基礎(chǔ),也為UPR廣譜抑制劑的篩選提供新的思路。
【關(guān)鍵詞】：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 未折疊蛋白應(yīng)答 IRE1α/XBP1 ROS 2-DG
【學(xué)位授予單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R363
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-13
• 第一章 前言13-30
• 1.1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激13-14
• 1.2 IRE1α—最保守的UPR感受器14-16
• 1.3 IRE1α-XBP1與疾病16-23
• 1.3.1 IRE1α-XBP1與腫瘤16-21
• 1.3.2 IRE1α-XBP1與代謝疾病21
• 1.3.3 IRE1α-XBP1其他一些相關(guān)疾病21-23
• 1.4 IRE1-XBP1通路調(diào)節(jié)劑的研究現(xiàn)狀23-25
• 1.4.1 IRE1α-XBP1抑制劑23-24
• 1.4.2 IRE1α-XBP1激活劑24-25
• 1.5 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與氧化應(yīng)激25-27
• 1.6 IRE1α-XBP1反應(yīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)27-28
• 1.7 論文研究目的與總體設(shè)計(jì)28-30
• 第二章 基于IRE1α-XBP1通路調(diào)節(jié)劑的篩選以及小分子化合物21#和17#的發(fā)現(xiàn)30-44
• 1 實(shí)驗(yàn)材料30-32
• 2 實(shí)驗(yàn)方法32-37
• 2.1 IRE1α核酸酶底物的設(shè)計(jì)32-33
• 2.2 IRE1α核酸酶活性測(cè)定體系及注意事項(xiàng)33-34
• 2.3 細(xì)胞培養(yǎng)34
• 2.4 細(xì)胞水平化合物篩選步驟34-35
• 2.5 RNase A測(cè)活體系35
• 2.6 Luciferase酶活測(cè)定35
• 2.7 RT-PCR35-37
• 2.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Q-PCR)37
• 2.9 數(shù)據(jù)處理與系統(tǒng)指標(biāo)37
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果37-42
• 3.1 細(xì)胞水平篩選獲得28個(gè)UPR小分子調(diào)節(jié)劑37-38
• 3.1.1 初篩37-38
• 3.1.2 復(fù)篩38
• 3.2 評(píng)價(jià)候選化合物分子水平對(duì)IRE1α核酸酶活性及細(xì)胞水平對(duì)XBP1剪切的影響38-41
• 3.2.1 候選化合物分子水平對(duì)IRE1α核酸酶活性的影響38-40
• 3.2.2 RT-PCR評(píng)價(jià)候選化合物在細(xì)胞水平對(duì)XBP1剪切的影響40-41
• 3.3 分子和細(xì)胞水平考察化合物作用的選擇性41-42
• 3.3.1 IRE1α核酸酶抑制劑對(duì)RNase A活性的影響41
• 3.3.2 細(xì)胞水平評(píng)價(jià)28個(gè)有效化合物對(duì)IRE1α-XBP1通路影響的選擇性41-42
• 4 討論與總結(jié)42-44
• 第三章 21#抑制IRE1α核酸酶活性的作用機(jī)制研究44-59
• 1 實(shí)驗(yàn)材料44
• 2 實(shí)驗(yàn)方法44-47
• 2.1 IRE1α激酶分子測(cè)活方法(HTRF)介紹44-45
• 2.2 激酶測(cè)活體系45-46
• 2.3 IRE1α核酸酶活性測(cè)定46
• 2.4 ROS檢測(cè)46
• 2.5 細(xì)胞培養(yǎng)46
• 2.6 RT-PCR和western blot46-47
• 2.7 數(shù)據(jù)處理與系統(tǒng)指標(biāo)47
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果47-56
• 3.1 星形孢菌素(STS)對(duì)IRE1α激酶活性的影響47
• 3.2 細(xì)胞水平21#對(duì)IRE1α酶活性的影響47-48
• 3.3 分子水平21#對(duì)IRE1α激酶活性的影響48-49
• 3.4 21#對(duì)IRE1α酶活性的抑制與孵育時(shí)間的關(guān)系49-50
• 3.5 DTT不同濃度對(duì)21#發(fā)揮酶活抑制作用的影響50-52
• 3.6 檢測(cè)DTT與21#反應(yīng)是否產(chǎn)生活性氧(ROS)52-53
• 3.7 檢測(cè)ROS部分清除后21#對(duì)IRE1α核酸酶活性的影響53-54
• 3.8 H_2O_2和zhang400-1對(duì)IRE1α酶活性的影響54-56
• 3.9 質(zhì)譜鑒定IRE1α可被氧化的保守半胱氨酸位點(diǎn)56
• 4 討論與總結(jié)56-59
• 第四章 IRE1α-XBP1非選擇性抑制劑17#及其改造系列化合物的抗腫瘤活性與作用機(jī)制研究59-71
• 1 實(shí)驗(yàn)材料60
• 2 實(shí)驗(yàn)方法60-62
• 2.1 RT-PCR,western blot,Q-PCR60-61
• 2.2 MTS法檢測(cè)細(xì)胞活率61
• 2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期61-62
• 2.4 數(shù)據(jù)處理與系統(tǒng)指標(biāo)62
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果62-69
• 3.1 17#對(duì)UPR下游因子轉(zhuǎn)錄水平的影響62-64
• 3.2 17#與2-DG共同作用抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)64-65
• 3.3 17#與2-DG共同作用引起細(xì)胞周期阻滯65-66
• 3.4 17#與2-DG的共同作用效應(yīng)與UPR相關(guān)66-67
• 3.5 17#及其改造化合物的相關(guān)評(píng)價(jià)67-69
• 4 總結(jié)及待解決的問題69-71
• 參考文獻(xiàn)71-75
• 附錄75-76
• 縮略語檢索表76-78
• 致謝78-79

【共引文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 楊芬;蔣志文;;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)腫瘤發(fā)展及化療反應(yīng)的影響[J];蚌埠醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2009年05期

2 劉宏莉;龔萍;劉浩;張旭東;蔣志文;;抑制葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78表達(dá)對(duì)阿霉素誘導(dǎo)人乳腺癌SK-BR-3細(xì)胞凋亡的增敏作用[J];蚌埠醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2010年06期

3 劉芳;邢曉明;李玉軍;趙潔;;結(jié)直腸腺癌組織Grp78表達(dá)及意義[J];青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2009年03期

4 陳干農(nóng);馬勇;楊竹林;;兒童肝母細(xì)胞瘤肝組織中GRP78和GRP94表達(dá)及其臨床病理意義[J];中國(guó)當(dāng)代兒科雜志;2010年08期

5 王利菊;王鎮(zhèn)山;王琪;;非小細(xì)胞肺癌體外化療藥物敏感性與GRP94表達(dá)的相關(guān)性[J];大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2009年04期

6 胡宗海;低氧與應(yīng)激蛋白研究進(jìn)展[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2003年18期

7 王利菊;王琪;王鎮(zhèn)山;于志紅;王錦光;熊海;尹強(qiáng);王鶯燕;王濤;佟淑萍;;非小細(xì)胞肺癌體外化療藥物敏感性與GRP78表達(dá)的相關(guān)性[J];中國(guó)肺癌雜志;2006年06期

8 趙亮;丁彥青;;FLAG Pull-down技術(shù)篩選LASP-1相互作用蛋白[J];廣東醫(yī)學(xué);2010年17期

9 ;Comparative Proteome Analysis of Breast Cancer and Adjacent Normal Breast Tissues in Human[J];Genomics Proteomics & Bioinformatics;2006年03期

10 張縈斐;黎樂群;葉新平;覃曉;彭濤;蘇銘;;GRP78蛋白和HSP60蛋白在原發(fā)性多結(jié)節(jié)肝癌中的表達(dá)及臨床意義[J];廣西醫(yī)學(xué);2010年01期

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 Ying Chun Chen;Xiao Yi Zeng;Yan He;Hong Liu;Bin Wang;Han Zhou;Jian-Wen Chen;Pei-Qing Liu;Lian Quan Gu;Ji Ming Ye;Zhi-Shu Huang;;Mechanism on Novel Rutaecarpine Analogue Potently Reducing Lipid Accumulation in Adipocytes[A];第八屆全國(guó)化學(xué)生物學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要集[C];2013年

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 王紹祥;新型Hsp90抑制劑SNX-2112的抗腫瘤作用及機(jī)制[D];暨南大學(xué);2011年

2 任路平;高果糖、高脂飲食致小鼠脂肪肝機(jī)制的探討[D];河北醫(yī)科大學(xué);2011年

3 馮若;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥的機(jī)制[D];鄭州大學(xué);2011年

4 周瑋;GRP78的表達(dá)與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系—Meta分析[D];華中科技大學(xué);2011年

5 周瑋;GRP78的表達(dá)與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系-Meta分析[D];華中科技大學(xué);2011年

6 王曉稼;分子伴侶相關(guān)基因ST13和Hsp70對(duì)乳腺癌生物學(xué)特性影響的研究[D];浙江大學(xué);2002年

7 王琪;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶GRP94、GRP78和PDI在人體肺癌組織中表達(dá)的研究[D];大連理工大學(xué);2002年

8 邢曉明;結(jié)直腸癌蛋白質(zhì)組學(xué)分析[D];浙江大學(xué);2005年

9 葉麗平;堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子抑制卵巢癌CAOV3細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2007年

10 袁擁華;抗腫瘤新藥德氮吡格的蛋白質(zhì)組學(xué)研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2007年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 李天強(qiáng);免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白在人骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá)及臨床意義[D];山東中醫(yī)藥大學(xué);2010年

2 賴麗琴;GRP78、GRP94蛋白和mRNA在人胃癌組織中的表達(dá)及臨床意義[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2011年

3 查麗霞;肝癌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后COX-2的表達(dá)變化及其對(duì)細(xì)胞凋亡的影響[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2011年

4 彭華;Clusterin和GRP78在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其與臨床病理特征之間的關(guān)系[D];川北醫(yī)學(xué)院;2011年

5 李祿椿;葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78與胃癌細(xì)胞化療敏感性的關(guān)系[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2011年

6 劉麗娟;納秒級(jí)陡脈沖誘導(dǎo)人卵巢癌細(xì)胞SKOV3凋亡的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)機(jī)制的研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2011年

7 屈琳;葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78在人胃癌細(xì)胞系和胃癌組織中的表達(dá)及其意義[D];中南大學(xué);2011年

8 董虹;GRP78與卵巢癌化療耐藥的關(guān)系及其機(jī)制的研究[D];華中科技大學(xué);2010年

9 馬媛;GRP78在腫瘤中的表達(dá)及衣霉素對(duì)其誘導(dǎo)表達(dá)[D];華中科技大學(xué);2009年

10 王黎;siRNA沉默survivin誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白的表達(dá)[D];華中科技大學(xué);2009年

，

本文編號(hào)：544410