本文關(guān)鍵詞：抗流感嗜血桿菌外膜蛋白P6單克隆抗體制備及鑒定

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【摘要】：流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae, Hi)是廣泛存在于健康人呼吸道的條件致病菌,可分為莢膜型和無(wú)莢膜型兩類(lèi),莢膜型包括a-f共6個(gè)血清型,無(wú)莢膜型又稱(chēng)為不可分型流感嗜血桿菌(nontypeable Haemophilus influenzae, NTHi)。Hi感染十分普遍,可引起腦膜炎、肺炎、關(guān)節(jié)膿腫等多種疾病,其臨床表現(xiàn)嚴(yán)重而缺乏獨(dú)特性,因此早期、快速的病原學(xué)檢測(cè)對(duì)Hi感染的診斷和治療都具有非常重要的意義。目前我國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室對(duì)Hi的檢測(cè)以培養(yǎng)法為主,其次有血清學(xué)方法與各種聚合酶鏈反應(yīng)。相比較而言,血清學(xué)方法操作簡(jiǎn)便、敏感性高、無(wú)需特殊儀器,具較高的臨床實(shí)用價(jià)值,但目前所用抗體試劑基本依賴(lài)進(jìn)口,價(jià)格昂貴,制約了它的使用。本研究旨在獲得理想的小鼠抗Hi單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株,以制備大量高純度的Hi單克隆抗體,為改善Hi抗體試劑依賴(lài)進(jìn)口的局面和進(jìn)一步開(kāi)發(fā)更準(zhǔn)確、快速的血清學(xué)診斷方法而打下基礎(chǔ)。P6蛋白是一種有莢膜和無(wú)莢膜的不可分型Hi菌株中均存在的重要外膜蛋白,遺傳上具有高度的保守性,而相對(duì)于其它種類(lèi)細(xì)菌又具有高度的特異性,因此,確定以P6蛋白作為制備單克隆抗體的特定免疫原。實(shí)驗(yàn)過(guò)程如下： 復(fù)蘇并擴(kuò)增基因工程重組菌BL21(pGEX-6p-2-P6),按照實(shí)驗(yàn)室確定的表達(dá)條件誘導(dǎo)融合蛋白GST-P6表達(dá),經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析證實(shí)結(jié)果與預(yù)期一致；利用谷胱甘肽微珠對(duì)融合標(biāo)簽GST的吸附作用純化重組蛋白,以分光光度計(jì)測(cè)定純化液的吸光度,計(jì)算出GST-P6蛋白的含量約為958μg·mL-1。 取純化的GST-P6與等體積弗氏完全佐劑充分乳化后腹腔免疫BALB/c小鼠,劑量為每只50μg；以后每隔2周,用相同劑量的免疫原和等體積弗氏不完全佐劑充分乳化后腹腔免疫,連續(xù)2次；間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)小鼠血清抗P6蛋白抗體滴度,有3只小鼠的抗體滴度達(dá)到1：10000以上；選擇滴度高者腹腔注射同等劑量不含佐劑的重組蛋白加強(qiáng)免疫1次,3d后進(jìn)行融合。 按常規(guī)程序留取免疫小鼠血清并制備脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞,加入聚乙二醇(PEG1500)進(jìn)行融合；以經(jīng)甲醛固定的標(biāo)準(zhǔn)Hi菌體和純化重組蛋白GST-P6分別作為檢測(cè)抗原,通過(guò)方陣實(shí)驗(yàn)確定抗原最佳包被濃度、陽(yáng)性與陰性血清最佳稀釋度等,建立間接ELISA法用于篩選雜交瘤細(xì)胞；用有限稀釋法對(duì)篩選出的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行亞克隆,共獲得2株抗P6蛋白單克隆抗體(McAb)細(xì)胞株,分別命名為α2G3和y2C4. 經(jīng)培養(yǎng)上清液檢測(cè),證實(shí)α2G3和y2C4兩株細(xì)胞在連續(xù)培養(yǎng)、多次傳代及凍存復(fù)蘇后均能穩(wěn)定分泌抗P6蛋白單克隆抗體；細(xì)胞培養(yǎng)上清液最高滴度分別為1：256和1：512.核型分析顯示雜交瘤細(xì)胞株α2G3的染色體眾數(shù)為103條,y2C4為95條,特征性的中間著絲粒染色體各為1條,符合融合細(xì)胞的特征。通過(guò)細(xì)胞數(shù)量、單抗產(chǎn)量等的觀(guān)察,推定a2G3的細(xì)胞周期約為4-5天。 以膠體金單克隆抗體試帶鑒定α2G3為IgG2b, y2C4為IgM,兩者均為Kappa型。間接ELISA檢測(cè)表明2種單抗可能識(shí)別P6蛋白不同表位；均只與標(biāo)準(zhǔn)或臨床分離的Hi菌株起反應(yīng),而與綠膿桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、大腸桿菌等均不反應(yīng),具有良好的特異性；檢出Hi標(biāo)準(zhǔn)株的最低包被濃度為每孔6.25×103個(gè)細(xì)菌,敏感性也較高。 本研究成功地制備了2株可穩(wěn)定產(chǎn)生抗Hi外膜蛋白P6單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,獲得了2種具有良好敏感性與特異性、可結(jié)合不同P6抗原表位的單克隆抗體,為進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)更準(zhǔn)確、快捷的Hi臨床檢測(cè)方法奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：流感嗜血桿菌 外膜蛋白P6 雜交瘤 單克隆抗體 間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)
【學(xué)位授予單位】：河北北方學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R392
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• 英文摘要6-9
• 英文縮寫(xiě)9-11
• 前言11-13
• 實(shí)驗(yàn)儀器與材料13-18
• 實(shí)驗(yàn)方法和步驟18-26
• 結(jié)果26-30
• 附圖30-35
• 附表35-40
• 討論40-45
• 結(jié)論45-46
• 參考文獻(xiàn)46-50
• 綜述50-65
• 參考文獻(xiàn)60-65
• 致謝65-66
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷66-67

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

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本文編號(hào)：544239