本文關(guān)鍵詞：恥垢分枝桿菌ligD和ku突變株的構(gòu)建

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【摘要】：結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)可引起結(jié)核病,是微生物中人類最大的敵人,據(jù)世界衛(wèi)生組織預(yù)測全球三分之一的人口感染了MTB, WHO的數(shù)據(jù)顯示,2011年全球新發(fā)現(xiàn)有870萬感染者患病,其中有110萬患者同時感染艾滋病毒,估計有140萬人死于結(jié)核病。因與艾滋病毒共同感染人體造成死亡的數(shù)目之巨,MTB已成為傳染病中的頭號殺手。雖然現(xiàn)已開發(fā)幾種抗結(jié)核類藥物但由于耐藥性的產(chǎn)生,這些藥物的控制效果遠遠達不到令人滿意的效果。結(jié)核病是一個從未解決的麻煩。 DNA雙鏈斷裂是普遍存在的一種DNA損傷,但其對于細胞來說是致命的。修復(fù)DNA雙鏈斷裂的途徑有同源重組(homologous recombination, HR)和非同源末端連接(non-homologous end-joining, NHEJ)。NHEJ最早是在哺乳動物細胞中發(fā)現(xiàn)的,并一直被認(rèn)為只存在于真核生物中,其在真核生物中對保持基因組的穩(wěn)定性有很重要的作用。但之后的研究發(fā)現(xiàn)NHEJ也普遍存在于一些病原微生物中,且與耐藥和免疫逃避相關(guān)。 現(xiàn)已知NHEJ修復(fù)途徑涉及兩個蛋白LigD和Ku,同時對這兩個蛋白的功能也有了一定的了解,而在NHEJ修復(fù)過程中,LigD同Ku的作用機制及調(diào)控方式還不是很明確。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)去乙�；窼ir2可能參與NHEJ修復(fù)途徑,還發(fā)現(xiàn)Ku的29位賴氨酸有乙�；揎�,這暗示了NHEJ修復(fù)的調(diào)控可能同Ku的K29乙�；揎椨嘘P(guān)。 我們以恥垢分枝桿菌做為模式生物使用無標(biāo)記基因敲除法來構(gòu)建ligD和ku兩個基因的不同突變體ligD ΔPolDom、TBku-his、ku-his、kuR29-his和kuQ29-his。無標(biāo)記基因敲除需要兩個質(zhì)粒,一個質(zhì)粒為p1NIL,為目的基因提供多克隆位點,第二個質(zhì)粒pGOAL,含有一個兩端為PacI酶切位點的標(biāo)記基因盒。標(biāo)記基因盒里有抗生素抗性基因、lacZ和sacB。構(gòu)建成的自殺質(zhì)粒含有pGOAL質(zhì)粒的標(biāo)記基因盒和修飾過的目的基因,最后經(jīng)過兩次篩選得到我們所要的突變體。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)同源臂的長度、堿處理質(zhì)粒時堿的終濃度、沉淀DNA溶液的pH等條件和第二次篩選的擴增培養(yǎng)時間等都影響雙交換法突變株的構(gòu)建。同時也發(fā)現(xiàn)M. smegmatis Ku的C端加His標(biāo)簽不影響其參與的NHEJ活性,這為后面檢測恥垢分枝桿菌ku突變株(kuR29-his和kuQ29-his)的NHEJ活性時,消除His標(biāo)簽引起NHEJ活性改變的影響。這些突變體為研究NHEJ修復(fù)的調(diào)控方式提供了重要的材料。
【關(guān)鍵詞】：恥垢分枝桿菌 非同源末端連接 Ku LigD 突變株
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R378.911
【目錄】：

• 目錄4-7
• 摘要7-8
• Abstract8-10
• 縮略語表10-11
• 1 前言11-29
• 1.1 結(jié)核分枝桿菌及其危害11-13
• 1.1.1 結(jié)核分枝桿菌11-12
• 1.1.2 結(jié)核分枝桿菌的危害12-13
• 1.2 結(jié)核分枝桿菌中的DNA修復(fù)13-15
• 1.3 真核生物的NHEJ15-18
• 1.3.1 真核中蛋白組成和互作16
• 1.3.2 真核NHEJ修復(fù)機制16-18
• 1.4 原核生物的NHEJ18-22
• 1.4.1 Ku蛋白19-20
• 1.4.2 LigD蛋白20-22
• 1.4.2.1 POL結(jié)構(gòu)域21
• 1.4.2.2 LIG結(jié)構(gòu)域21
• 1.4.2.3 PE結(jié)構(gòu)域21-22
• 1.5 結(jié)核分枝桿菌中的NHEJ22-25
• 1.6 蛋白質(zhì)的乙�；揎�25
• 1.7 基因敲除原理25-28
• 1.8 研究目的與意義28-29
• 2 材料和方法29-43
• 2.1 材料29-33
• 2.1.1 質(zhì)粒與菌株29-30
• 2.1.2 培養(yǎng)基30
• 2.1.3 主要試劑30
• 2.1.4 主要溶液30-32
• 2.1.5 主要實驗儀器32-33
• 2.2 方法33-43
• 2.2.1 目的片斷的克隆33-36
• 2.2.1.1 構(gòu)建pZY73質(zhì)粒的目的基因片段33-34
• 2.2.1.2 構(gòu)建pZY75質(zhì)粒的目的基因片段34-35
• 2.2.1.3 構(gòu)建pZY91質(zhì)粒的目的基因片段35-36
• 2.2.2 電轉(zhuǎn)質(zhì)粒的構(gòu)建36-38
• 2.2.2.1 p1NIL與pGOAL質(zhì)粒的制備36-37
• 2.2.2.2 p1NIL質(zhì)粒的酶切37
• 2.2.2.3 目的片段與酶切后的p1NIL連接37
• 2.2.2.4 p1NIL-目的片段重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化37-38
• 2.2.2.5 PacⅠ酶切重組質(zhì)粒與pGOAL質(zhì)粒38
• 2.2.2.6 pGOAL質(zhì)粒與p1NIL-target gene的連接38
• 2.2.2.7 電轉(zhuǎn)質(zhì)粒載體的轉(zhuǎn)化38
• 2.2.3 基因敲除38-40
• 2.2.3.1 感受態(tài)的制備38-39
• 2.2.3.2 質(zhì)粒的預(yù)處理39
• 2.2.3.3 電轉(zhuǎn)39-40
• 2.2.3.4 第二次篩選40
• 2.2.4 突變體陽性檢測40-43
• 2.2.4.1 PCR驗證第二次篩選40
• 2.2.4.2 Western Blot驗證40-41
• 2.2.4.3 M.smegmatis ku-his菌株中的Ku-His蛋白純化41-42
• 2.2.4.4 SDS-PAGE分析蛋白純度和分子量42
• 2.2.4.5 NHEJ效率檢測42-43
• 3 結(jié)果與分析43-51
• 3.1 目的片段的構(gòu)建43-44
• 3.1.1 pZY73質(zhì)粒的目的基因片段43
• 3.1.2 pZY75質(zhì)粒的目的基因片段43-44
• 3.1.3 pZY91質(zhì)粒的目的基因片段44
• 3.2 p1NIL與pGOAL質(zhì)粒的酶切44-45
• 3.3 pZY73、pZY75與pZY91質(zhì)粒酶切驗證45-46
• 3.4 堿處理的條件46-47
• 3.5 第二次篩選47
• 3.6 第二次篩選后菌落PCR驗證47-48
• 3.7 第二次篩選后菌落Western Blot驗證48-49
• 3.8 M smegmatis mc~2 155 ku-his菌株的Ku-His蛋白的大量純化49
• 3.9 NHEJ修復(fù)效率檢測49-51
• 4 討論51-53
• 參考文獻53-58
• 致謝58

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本文編號：538096