本文關鍵詞：A族鏈球菌M蛋白在誘導巨噬細胞活化及調節(jié)中的作用

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【摘要】：目的：A族鏈球菌（Group A streptococcus, GAS）是一種以人類為唯一宿主的細菌，感染后若治療不及時可引發(fā)多種嚴重的疾病。本室在GAS致炎機制及免疫逃逸方面做了大量工作。M蛋白位于GAS的表面，是它的主要的毒力因子，研究顯示M蛋白有著較強的致炎能力，且有助于GAS逃避巨噬細胞的吞噬。結合本室前期工作，本課題對M蛋白在誘導及調節(jié)巨噬細胞活化方面做繼續(xù)研究。 巨噬細胞是機體重要的效應細胞，活化的巨噬細胞可以分泌促炎癥因子如IL-1β、IL-6、TNF-α等，這些因子在誘導炎癥反應、抗感染免疫中發(fā)揮著重要作用。炎癥的發(fā)展過程中受許多負調控因子的作用，我們對腫瘤壞死因子α誘導蛋白3（A20）予以了特別的關注，A20是炎癥信號傳導的中心--轉錄因子NF-κB的抑制因子，而M蛋白對A20的誘導產生，發(fā)揮作用有著怎樣的影響？同時IL-10是一種強烈的抑制單核巨噬細胞分泌炎癥因子的細胞因子，在巨噬細胞受到M蛋白刺激時它的表達情況如何？細胞因子信號轉導抑制子（SOCS）是細胞信號JAK/STAT通路以及MYD88/NF-κB通路的負調控因子，在M蛋白所致巨噬細胞炎癥發(fā)展過程中它的表達量如何？對于以上疑問，本課題旨在做初步研究。因此，在本研究中我們首先表達了M蛋白，同時構建并表達另一種由GAS分泌的蛋白SpeB作為對照蛋白，通過對比兩種蛋白分別刺激巨噬細胞后的促炎細胞因子及相關負調控因子的表達情況來驗證M蛋白是否與其他GAS相關蛋白在促進炎癥以及表達負調控因子方面是否存在差異，以期為今后在M蛋白誘導巨噬細胞負調控因子表達方面更深入的研究奠定基礎。 通過以上工作，旨在深化對于GAS的認識，以期為臨床更精確的靶向治療提供實驗依據。 方法： 1目的蛋白制備:將本室已有的含有M蛋白表達質粒pEGX2-T的貯存菌DH-5α提取質粒并轉染表達菌E.coli BL21，用IPTG誘導表達M蛋白，經SDS-PAGE鑒定后，純化，定量。構建SpeB蛋白的表達質粒pET28a-SpeB，轉染表達菌E.coli BL21后表達蛋白，純化，定量。 2細胞毒性試驗以及蛋白作用濃度的選擇：首先MTT法檢測M蛋白和SpeB蛋白的細胞毒性，鱟試劑盒檢測融合蛋白LPS含量，然后參考以0.1、1、5、10μg/ml濃度的M蛋白作用于巨噬細胞RAW264.7后A20的表達情況，以確定適合刺激濃度。 3以PBS為陰性對照，以LPS為陽性對照(用量10ng/μl)，M蛋白和SpeB蛋白分別刺激RAW264.7細胞后細胞因子的表達：以10μg/ml濃度的M蛋白和SpeB蛋白分別刺激RAW264.7細胞2、4、8、12小時后行Realtime-PCR檢測細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α以及負調控因子A20、IL-10、SOCS1和SOCS3的mRNA表達水平。 4M蛋白刺激RAW264.7細胞后A20、P65及TRAF6的表達：以10μg/ml濃度的M蛋白刺激RAW264.7細胞4、8、12、24小時后Western blot檢測P65，A20及其下游分子TRAF6。 5M蛋白刺激C57小鼠BMDM細胞后A20、P65及TRAF6的表達：以10μg/ml濃度的M蛋白刺激小鼠BMDM細胞4、8、12、24小時后Western blot檢測P65，A20及其下游分子TRAF6。 結果： 1表達并純化M蛋白，蛋白定量濃度為160μg/ml。構建、表達、并純化SpeB蛋白，蛋白定量75μg/ml。 2經MTT檢測顯示M蛋白濃度小于20μg/ml的時候對細胞無毒性,LPS含量為1.015ng/μl；SpeB蛋白小于16μg/ml的時候對細胞無毒性，LPS含量為0.786ng/μl。確定以10μg/ml作為蛋白作用濃度。 3M蛋白刺激RAW264.7細胞2、4、8、12小時后行Realtime-PCR檢測結果顯示TNF-α、IL-1β、IL-6各細胞因子較對照均表達增高，多個時間點有顯著性差異（P0.05）。其中IL-1β和IL-6較TNF-α增高明顯，在8小時左右達峰值。負調控因子方面A20表達增高明顯，在4小時左右達到高峰，與對照相比，除4小時外皆有顯著性差異（P0.05）。 IL-10、SOCS1和SOCS3均有不同程度增高。同時用SpeB蛋白做平行實驗，結果顯示TNF-α、IL-1β、IL-6各細胞因子較對照均表達增高，但相對低于M蛋白刺激后的結果，而負調控因子A20、SOCS1和SOCS3的表達顯著低于M蛋白刺激后的結果，IL-10的表達更是低于正常對照。 4M蛋白刺激RAW264.7細胞4、8、12、24小時后經Western blot檢測顯示A20表達量在12小時以前呈逐漸增高，24小時A20的表達與12小時比較是降低的。M蛋白刺激RAW264.7細胞4、8、12、24小時后行Western blot檢測P65和TRAF6結果顯示P65表達增高明顯且在24小時以內持續(xù)增高，表明NF-κB通路處于被激活的狀態(tài)，，而TRAF6的表達量在24小時內呈動態(tài)變化，即8小時和24小時的變化量要分別低于4小時和12小時。 5M蛋白相同條件刺激BMDM細胞4、8、12、24小時行Western blot檢測A20結果顯示A20在12小時以內的表達量逐漸增高，24小時后的表達量低于12小時；P65的表達在24小時內是逐漸增高的而TRAF6的變化趨勢與RAW264.7細胞相同。 結論： 1M蛋白和SpeB蛋白均能促進巨噬細胞分泌促炎細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α，但M蛋白的致炎能力要明顯強于SpeB蛋白，同時在刺激負反饋因子表達方面M蛋白也是要高于SpeB蛋白。 2M蛋白可能通過NF-κB途徑來激活細胞，也可以通過一定的途徑激活負調節(jié)因子A20。 3負調控因子A20可以通過作用于NF-κB炎癥通路上的底物分子TRAF6使之降解從而起到一定的抑制炎癥的作用。
【關鍵詞】：M蛋白 巨噬細胞 負調控因子 A20 TRAF6
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R363
【目錄】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-11
• 前言11-12
• 材料與方法12-30
• 結果30-31
• 附圖31-42
• 附表42-44
• 討論44-46
• 結論46-47
• 參考文獻47-49
• 綜述 A 族鏈球菌 M 蛋白的分型及致病機制49-58
• 參考文獻54-58
• 致謝58-59
• 個人簡歷59

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本文編號：530316