本文關(guān)鍵詞：A族鏈球菌M蛋白在誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化及調(diào)節(jié)中的作用

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【摘要】：目的：A族鏈球菌（Group A streptococcus, GAS）是一種以人類為唯一宿主的細(xì)菌，感染后若治療不及時(shí)可引發(fā)多種嚴(yán)重的疾病。本室在GAS致炎機(jī)制及免疫逃逸方面做了大量工作。M蛋白位于GAS的表面，是它的主要的毒力因子，研究顯示M蛋白有著較強(qiáng)的致炎能力，且有助于GAS逃避巨噬細(xì)胞的吞噬。結(jié)合本室前期工作，本課題對(duì)M蛋白在誘導(dǎo)及調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞活化方面做繼續(xù)研究。 巨噬細(xì)胞是機(jī)體重要的效應(yīng)細(xì)胞，活化的巨噬細(xì)胞可以分泌促炎癥因子如IL-1β、IL-6、TNF-α等，這些因子在誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)、抗感染免疫中發(fā)揮著重要作用。炎癥的發(fā)展過程中受許多負(fù)調(diào)控因子的作用，我們對(duì)腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白3（A20）予以了特別的關(guān)注，A20是炎癥信號(hào)傳導(dǎo)的中心--轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的抑制因子，而M蛋白對(duì)A20的誘導(dǎo)產(chǎn)生，發(fā)揮作用有著怎樣的影響？同時(shí)IL-10是一種強(qiáng)烈的抑制單核巨噬細(xì)胞分泌炎癥因子的細(xì)胞因子，在巨噬細(xì)胞受到M蛋白刺激時(shí)它的表達(dá)情況如何？細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制子（SOCS）是細(xì)胞信號(hào)JAK/STAT通路以及MYD88/NF-κB通路的負(fù)調(diào)控因子，在M蛋白所致巨噬細(xì)胞炎癥發(fā)展過程中它的表達(dá)量如何？對(duì)于以上疑問，本課題旨在做初步研究。因此，在本研究中我們首先表達(dá)了M蛋白，同時(shí)構(gòu)建并表達(dá)另一種由GAS分泌的蛋白SpeB作為對(duì)照蛋白，通過對(duì)比兩種蛋白分別刺激巨噬細(xì)胞后的促炎細(xì)胞因子及相關(guān)負(fù)調(diào)控因子的表達(dá)情況來驗(yàn)證M蛋白是否與其他GAS相關(guān)蛋白在促進(jìn)炎癥以及表達(dá)負(fù)調(diào)控因子方面是否存在差異，以期為今后在M蛋白誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞負(fù)調(diào)控因子表達(dá)方面更深入的研究奠定基礎(chǔ)。 通過以上工作，旨在深化對(duì)于GAS的認(rèn)識(shí)，以期為臨床更精確的靶向治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 1目的蛋白制備:將本室已有的含有M蛋白表達(dá)質(zhì)粒pEGX2-T的貯存菌DH-5α提取質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染表達(dá)菌E.coli BL21，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)M蛋白，經(jīng)SDS-PAGE鑒定后，純化，定量。構(gòu)建SpeB蛋白的表達(dá)質(zhì)粒pET28a-SpeB，轉(zhuǎn)染表達(dá)菌E.coli BL21后表達(dá)蛋白，純化，定量。 2細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及蛋白作用濃度的選擇：首先MTT法檢測M蛋白和SpeB蛋白的細(xì)胞毒性，鱟試劑盒檢測融合蛋白LPS含量，然后參考以0.1、1、5、10μg/ml濃度的M蛋白作用于巨噬細(xì)胞RAW264.7后A20的表達(dá)情況，以確定適合刺激濃度。 3以PBS為陰性對(duì)照，以LPS為陽性對(duì)照(用量10ng/μl)，M蛋白和SpeB蛋白分別刺激RAW264.7細(xì)胞后細(xì)胞因子的表達(dá)：以10μg/ml濃度的M蛋白和SpeB蛋白分別刺激RAW264.7細(xì)胞2、4、8、12小時(shí)后行Realtime-PCR檢測細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α以及負(fù)調(diào)控因子A20、IL-10、SOCS1和SOCS3的mRNA表達(dá)水平。 4M蛋白刺激RAW264.7細(xì)胞后A20、P65及TRAF6的表達(dá)：以10μg/ml濃度的M蛋白刺激RAW264.7細(xì)胞4、8、12、24小時(shí)后Western blot檢測P65，A20及其下游分子TRAF6。 5M蛋白刺激C57小鼠BMDM細(xì)胞后A20、P65及TRAF6的表達(dá)：以10μg/ml濃度的M蛋白刺激小鼠BMDM細(xì)胞4、8、12、24小時(shí)后Western blot檢測P65，A20及其下游分子TRAF6。 結(jié)果： 1表達(dá)并純化M蛋白，蛋白定量濃度為160μg/ml。構(gòu)建、表達(dá)、并純化SpeB蛋白，蛋白定量75μg/ml。 2經(jīng)MTT檢測顯示M蛋白濃度小于20μg/ml的時(shí)候?qū)?xì)胞無毒性,LPS含量為1.015ng/μl；SpeB蛋白小于16μg/ml的時(shí)候?qū)?xì)胞無毒性，LPS含量為0.786ng/μl。確定以10μg/ml作為蛋白作用濃度。 3M蛋白刺激RAW264.7細(xì)胞2、4、8、12小時(shí)后行Realtime-PCR檢測結(jié)果顯示TNF-α、IL-1β、IL-6各細(xì)胞因子較對(duì)照均表達(dá)增高，多個(gè)時(shí)間點(diǎn)有顯著性差異（P0.05）。其中IL-1β和IL-6較TNF-α增高明顯，在8小時(shí)左右達(dá)峰值。負(fù)調(diào)控因子方面A20表達(dá)增高明顯，在4小時(shí)左右達(dá)到高峰，與對(duì)照相比，除4小時(shí)外皆有顯著性差異（P0.05）。 IL-10、SOCS1和SOCS3均有不同程度增高。同時(shí)用SpeB蛋白做平行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示TNF-α、IL-1β、IL-6各細(xì)胞因子較對(duì)照均表達(dá)增高，但相對(duì)低于M蛋白刺激后的結(jié)果，而負(fù)調(diào)控因子A20、SOCS1和SOCS3的表達(dá)顯著低于M蛋白刺激后的結(jié)果，IL-10的表達(dá)更是低于正常對(duì)照。 4M蛋白刺激RAW264.7細(xì)胞4、8、12、24小時(shí)后經(jīng)Western blot檢測顯示A20表達(dá)量在12小時(shí)以前呈逐漸增高，24小時(shí)A20的表達(dá)與12小時(shí)比較是降低的。M蛋白刺激RAW264.7細(xì)胞4、8、12、24小時(shí)后行Western blot檢測P65和TRAF6結(jié)果顯示P65表達(dá)增高明顯且在24小時(shí)以內(nèi)持續(xù)增高，表明NF-κB通路處于被激活的狀態(tài)，，而TRAF6的表達(dá)量在24小時(shí)內(nèi)呈動(dòng)態(tài)變化，即8小時(shí)和24小時(shí)的變化量要分別低于4小時(shí)和12小時(shí)。 5M蛋白相同條件刺激BMDM細(xì)胞4、8、12、24小時(shí)行Western blot檢測A20結(jié)果顯示A20在12小時(shí)以內(nèi)的表達(dá)量逐漸增高，24小時(shí)后的表達(dá)量低于12小時(shí)；P65的表達(dá)在24小時(shí)內(nèi)是逐漸增高的而TRAF6的變化趨勢(shì)與RAW264.7細(xì)胞相同。 結(jié)論： 1M蛋白和SpeB蛋白均能促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α，但M蛋白的致炎能力要明顯強(qiáng)于SpeB蛋白，同時(shí)在刺激負(fù)反饋因子表達(dá)方面M蛋白也是要高于SpeB蛋白。 2M蛋白可能通過NF-κB途徑來激活細(xì)胞，也可以通過一定的途徑激活負(fù)調(diào)節(jié)因子A20。 3負(fù)調(diào)控因子A20可以通過作用于NF-κB炎癥通路上的底物分子TRAF6使之降解從而起到一定的抑制炎癥的作用。
【關(guān)鍵詞】：M蛋白 巨噬細(xì)胞 負(fù)調(diào)控因子 A20 TRAF6
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R363
【目錄】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-11
• 前言11-12
• 材料與方法12-30
• 結(jié)果30-31
• 附圖31-42
• 附表42-44
• 討論44-46
• 結(jié)論46-47
• 參考文獻(xiàn)47-49
• 綜述 A 族鏈球菌 M 蛋白的分型及致病機(jī)制49-58
• 參考文獻(xiàn)54-58
• 致謝58-59
• 個(gè)人簡歷59

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本文編號(hào)：530316