本文關(guān)鍵詞：PRMT5對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響

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【摘要】：目的： 該研究主要探索骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）成骨分化過程中的表觀遺傳學(xué)之甲基化修飾的改變，主要觀察蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶5（protein arginine methyl transferase，PRMT5）的變化。實(shí)驗(yàn)從基因及蛋白水平檢測(cè)PRMT5在BMSCs成骨分化過程的變化，為進(jìn)一步研究表觀遺傳對(duì)BMSCs成骨分化的影響提供基礎(chǔ)。 方法： 1.提取SD大鼠BMSCs，用全骨髓貼壁法進(jìn)行培養(yǎng)得到P3代細(xì)胞，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)過程的形態(tài)變化，并用酶標(biāo)儀檢測(cè)生長(zhǎng)曲線，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞相關(guān)表面抗原的表達(dá)情況，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行經(jīng)典成骨誘導(dǎo)，并用茜素紅染色，觀察細(xì)胞成骨分化能力，鑒定BMSCs。 2.從基因水平檢測(cè)PRMT5在BMSCs成骨分化過程的變化，將P3代細(xì)胞種于6孔板，實(shí)驗(yàn)分實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組用經(jīng)典成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)細(xì)胞，對(duì)照組用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)細(xì)胞，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）法分別檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組培養(yǎng)3天、6天、12天和24天的PRMT5基因表達(dá)情況，并繪制變化趨勢(shì)曲線圖進(jìn)行對(duì)比。 3.從蛋白水平檢測(cè)PRMT5在BMSCs成骨分化過程的變化，將P3代細(xì)胞種于6孔板，實(shí)驗(yàn)分實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組用經(jīng)典成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)細(xì)胞，對(duì)照組用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)細(xì)胞，用western blot方法分別檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組培養(yǎng)3天、6天、12天和24天的PRMT5蛋白表達(dá)情況，并進(jìn)行對(duì)比。 結(jié)果： 1.全骨髓貼壁法獲得的P3代BMSCs生長(zhǎng)增值良好，顯微鏡下見呈漩渦狀生長(zhǎng)，酶標(biāo)儀檢測(cè)生長(zhǎng)曲線變化符合典型BMSCs特征，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗原表達(dá)正常，其中CD29表達(dá)99.93%，CD44表達(dá)99.46%，CD31表達(dá)0.01%，CD45表達(dá)0.01%，成骨誘導(dǎo)21天后茜素紅染色可見明顯鈣結(jié)節(jié)，證明所提細(xì)胞為BMSCs。 2.提取細(xì)胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄后，加PRMT5引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物，用瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證所需產(chǎn)物為目標(biāo)基因即PRMT5基因，進(jìn)行qPCR結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組3-24天的PRMT5的mRNA表達(dá)量呈下降趨勢(shì)，而對(duì)照組3-24天PRMT5的mRNA表達(dá)量基本不變。 3.提取細(xì)胞總蛋白后，用western blot方法檢測(cè)PRMT5蛋白表達(dá)水平，用PRMT5單克隆抗體及二抗孵育后用ECL發(fā)光液進(jìn)行顯色拍照發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組3-24天PRMT5蛋白表達(dá)呈下降趨勢(shì)，而對(duì)照組3-24天PRMT5蛋白表達(dá)基本不變。 結(jié)論： 1.全骨髓貼壁法適合BMSCs的提取，純化。 2. PRMT5在BMSCs成骨分化過程基因及蛋白均表達(dá)降低，可能扮演抑制BMSCs成骨分化的角色。
【關(guān)鍵詞】：PRMT5 BMSCs 表觀遺傳學(xué) qPCR western blot
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R329.2
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-8
• 1 緒論8-16
• 1.1 BMSCs 概況8-9
• 1.2 表觀遺傳概況9-14
• 1.3 本研究的設(shè)計(jì)思路與內(nèi)容14
• 1.4 本研究的創(chuàng)新與不足14-16
• 2 實(shí)驗(yàn)一 BMSCs 提取、培養(yǎng)及鑒定16-30
• 2.1 研究目的16
• 2.2 實(shí)驗(yàn)材料16-17
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法17-22
• 2.4 結(jié)果22-23
• 2.5 討論23-25
• 2.6 結(jié)論25
• 2.7 附圖25-30
• 3 實(shí)驗(yàn)二 BMSCs 成骨誘導(dǎo)過程 PRMT5 的 mRNA 表達(dá)情況30-39
• 3.1 研究目的30
• 3.2 實(shí)驗(yàn)材料30-31
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法31-35
• 3.4 結(jié)果35-37
• 3.5 討論37-38
• 3.6 結(jié)論38-39
• 4 實(shí)驗(yàn)三 BMSCs 成骨誘導(dǎo)過程 PRMT5 的蛋白表達(dá)情況39-46
• 4.1 研究目的39
• 4.2 實(shí)驗(yàn)材料39-40
• 4.3 實(shí)驗(yàn)方法40-43
• 4.4 結(jié)果43-44
• 4.5 討論44-45
• 4.6 結(jié)論45-46
• 5 英文縮略詞46-47
• 6 參考文獻(xiàn)47-53
• 7 發(fā)表論文及參與學(xué)術(shù)活動(dòng)53-54
• 8 致謝54-55

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