本文關(guān)鍵詞：與羊膜上皮細胞共培養(yǎng)對羊膜間充質(zhì)干細胞生物學特性的影響

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【摘要】：目的：成體干細胞是具有多向分化潛能的細胞,在組織工程、細胞移植及基因工程方面具有良好的應用前景。近年來的研究發(fā)現(xiàn),人羊膜間充質(zhì)干細胞(human amniotic mesenchymal stem cells, hAMSC)在體外具有與骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cell, BMSC)相似的造血重建功能,并因其取材方便、來源豐富等優(yōu)勢有望成為一種更加理想的MSC臨床及科研新來源。同樣來源于羊膜的羊膜上皮細胞(amniotic epithelial cells, AEC)不僅具備干細胞的生物學特性,還能分泌多種細胞因子。本課題旨在探索AMSC與AEC在體外共培養(yǎng)后,AMSC生物學特性的變化。SDF-1/CXC4軸是介導MSC在體內(nèi)歸巢及植入的重要的生物軸,本研究對比共培養(yǎng)前后AMSC中CXCR4的表達,探討SDF-1/CXCR4軸在AMSC歸巢、遷移過程中的作用,以期為AMSC臨床應用奠定基礎(chǔ),并希望為臨床提高MSC移植療效提供實驗依據(jù)。 方法：分別采用組織塊法和消化法從羊膜中分離、培養(yǎng)AMSC和AEC,用密度梯度離心法從健康人骨髓標本中分離、培養(yǎng)BMSC,進行擴增及鑒定。選取P3代傳代培養(yǎng)24h后AMSC和BMSC的培養(yǎng)基上清液,檢測其中IL-6的含量,同時對比兩種細胞上IL-6受體(CD126)的表達。用millicell小室建立間接共培養(yǎng)體系,實驗分組為AMSC與AEC共培養(yǎng)組、無血清AMSC培養(yǎng)組、血清AMSC培養(yǎng)組(即常規(guī)培養(yǎng)組),應用CCK-8法及臺盼藍染色法觀察共培養(yǎng)24h、48h、72h對AMSC細胞活力的影響；采取包括流式免疫分析、real-time RT-PCR等方法對AMSC中CXCR4的表達進行檢測,并結(jié)合millicell小室探索共培養(yǎng)對AMSC體外遷移能力的影響。 結(jié)果：1、從羊膜分離出的AMSC在形態(tài)和表型上均符合MSC特征,流式分析顯示其上表達CD29、CD44、CD105,不表達或低表達CDlla、CD11b、CD31、CD34、 CD45、HLA-DR、pan-CK。2、AMSC與BMSC有相似生物學特性,二者流式免疫表型基本一致。3、AMSC能合成和分泌比BMSC更為豐富的IL-6,同時CD126的表達亦高于BMSC。4、通過CCK-8法顯示：雖然在24h三組細胞增殖活性無明顯差異,但是在48h、72h后共培養(yǎng)組細胞與血清培養(yǎng)組細胞的活性明顯的高于無血清AMSC組。5、臺盼藍染色進一步證實,無論在哪個時間位點,共培養(yǎng)組及血清培養(yǎng)組的存活率均高于無血清培養(yǎng)組。6、流式細胞儀檢測提示：AMSC胞內(nèi)的CXCR4在24h內(nèi)呈現(xiàn)出共培養(yǎng)組高于無血清培養(yǎng)組的表達,但與血清培養(yǎng)組無明顯差異,在接下來的48h及72h,三組細胞CXCR4的胞內(nèi)表達無明顯差別；對于細胞表面CXCR4,三個培養(yǎng)時間位點卻均顯示出血清培養(yǎng)組在CXCR4表面表達的劣勢,而共培養(yǎng)與無血清培養(yǎng)組之間的表達無差別。7、通過real-time RT-PCR在mRNA水平上檢測三種培養(yǎng)方式對細胞中CXCR4的表達,結(jié)果表明共培養(yǎng)及無血清培養(yǎng)組在三個時間位點均高于血清培養(yǎng)組,而共培養(yǎng)與無血清培養(yǎng)組之間差異無統(tǒng)計學差異。8、AMSC體外能夠沿SDF-1濃度梯度趨化遷移,共培養(yǎng)組與無血清培養(yǎng)組遷移細胞數(shù)無統(tǒng)計學差別,但兩組的AMSC的遷移數(shù)在三個時間位點均高于血清培養(yǎng)組。 結(jié)論：AMSC與AEC能夠在體外分離、培養(yǎng)、擴增。AMSC在體外與BMSC有相似的生物學特性,二者均能合成和分泌IL-6,但AMSC表達更為豐富的IL-6受體(CD126),提示在組織的損傷修復及造血調(diào)控方面,AMSC可能具有比BMSC更廣闊的應用前景。經(jīng)AEC共培養(yǎng)的AMSC表現(xiàn)出良好的生長活性,并能上調(diào)CXCR4的表達,增強其遷移能力。
【關(guān)鍵詞】：羊膜間充質(zhì)干細胞 羊膜上皮細胞 歸巢 CD126 CXCR4 遷移
【學位授予單位】：昆明醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R329.2
【目錄】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-10
• 第一部分 AMSC與AEC的分離培養(yǎng)及鑒定10-34
• 實驗材料11-14
• 實驗方法14-19
• 結(jié)果19-31
• 討論31-34
• 第二部分 與AEC共培養(yǎng)對AMSC生物學特性的影響34-55
• 實驗材料35-37
• 實驗方法37-44
• 實驗結(jié)果44-52
• 討論52-55
• 結(jié)論55-56
• 參考文獻56-59
• 綜述59-67
• 參考文獻64-67
• 英文縮寫詞一覽表67-68
• 攻讀學位期間發(fā)表論文情況68-69
• 致謝69

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 章守琴;李維佳;史明霞;錢永海;;人羊膜間充質(zhì)干細胞支持造血的體外實驗[J];中國組織工程研究與臨床康復;2010年49期

2 趙智剛,唐曉瓊,李靜,史明霞,鄒萍;慢性粒細胞性白血病骨髓間充質(zhì)干細胞的分離純化及其功能特性的研究[J];中華醫(yī)學雜志;2005年29期

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本文編號：518295