本文關(guān)鍵詞：rAAV8-1.3HBV介導(dǎo)的HBV慢性感染—小鼠藥物評價模型的建立

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【摘要】：目的 乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV），是引起人類急慢性肝炎的主要病原體之一。全球約1/3的人曾感染HBV，我國屬于HBV感染的高流行區(qū)，乙型肝炎表面抗原（Hepatitis B surface antigen，HBsAg）陽性率接近10%。目前，對HBV的研究主要以應(yīng)用HBV相關(guān)的動物模型為主，又以小鼠模型應(yīng)用最為廣泛�，F(xiàn)階段常用于HBV研究的小鼠模型包括：轉(zhuǎn)基因小鼠模型和水動力質(zhì)粒法構(gòu)建的HBV小鼠模型。但這兩種模型均因各自存在缺陷，使得應(yīng)用受到限制。 2010年本課題組制備出攜帶1.3拷貝HBV基因組（ayw亞型）的重組8型腺相關(guān)病毒（rAAV8-1.3HBV），尾靜脈注射C57BL/6小鼠后，初步檢測到病毒在小鼠體內(nèi)持續(xù)成功表達(dá)。為進(jìn)一步評價該方法制備小鼠模型的成模情況，探索該模型是否可作為新的抗HBV藥物篩選和評價的動物模型，故進(jìn)行此實驗。 方法 1.模型的建立及評價 選取4到6周齡雄性C57BL/6小鼠30只，按照1×1011vg劑量，尾靜脈注射rAAV8-1.3HBV病毒至30只小鼠體內(nèi)。病毒注射后第2周、第4周定性檢測血清學(xué)HBeAg、HBsAg的表達(dá)情況，第6周定量檢測血清學(xué)HBV DNA、HBeAg、HBsAg的表達(dá)情況。結(jié)合血清學(xué)定量、定性檢測結(jié)果，在30只小鼠中選取建模成功的小鼠用于后續(xù)實驗。 2.藥物實驗的分組及給藥策略 將建模成功的rAAV8-1.3HBV介導(dǎo)的慢性感染小鼠隨機(jī)分為恩替卡韋高、低劑量組，拉米夫定高、低劑量組，生理鹽水組及空白對照組，采用灌胃給藥的方式，給藥10天后停藥15天。 3.藥效的評價指標(biāo) 實驗過程中給藥5天、給藥10天、停藥15天三個時間點(diǎn)分別定量檢測小鼠血清學(xué)HBV DNA、HBeAg、HBsAg的表達(dá)水平。對比給藥前后、停藥前后小鼠血清學(xué)HBV DNA、HBeAg、HBsAg的變化情況，采用統(tǒng)計學(xué)分析，最終得出結(jié)論。 4.各指標(biāo)檢測方法 血清學(xué)HBV DNA的表達(dá)情況采用熒光定量PCR方法檢測，HBeAg和HBsAg的表達(dá)情況采用定性、定量ELISA方法檢測。 結(jié)果 1.小鼠成模情況評價 1.1ELISA定性檢測結(jié)果病毒注射第14天檢測小鼠血清學(xué)HBeAg和HBsAg表達(dá)水平顯示，30只小鼠中28只HBeAg表達(dá)為陽性，HBsAg全部表達(dá)為陽性；第28天檢測結(jié)果顯示，29只建模小鼠HBeAg表達(dá)陽性，HBsAg全部表達(dá)為陽性。 1.2HBV DNA定量檢測結(jié)果病毒注射第42天檢測小鼠血清學(xué)HBV DNA(lg (IU/mL))的表達(dá)情況顯示，，30只小鼠中27只HBV DNA表達(dá)大于5.0。 1.3ELISA定量檢測結(jié)果病毒注射第42天檢測小鼠血清學(xué)HBeAg和HBsAg表達(dá)水平顯示，除3只小鼠HBeAg、HBsAg表達(dá)相對較低，其余27只小鼠血清HBeAg平均值13.22±1.78S/CO，HBsAg平均值93.24±7.24mIU/mL。 結(jié)合HBV DNA表達(dá)水平及ELISA定性、定量結(jié)果，最終選取27只小鼠作為后續(xù)模型使用，建模成功率達(dá)90%。 2.藥物處理對小鼠模型血清HBV DNA表達(dá)的影響 對模型小鼠應(yīng)用核苷酸類似物后觀察到，恩替卡韋低劑量組給藥10天后血清學(xué)HBV DNA表達(dá)水平下降明顯，與同一天生理鹽水組對比差異存在統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），停藥15天后明顯回復(fù)，與該組給藥10天時對比差異存在統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。恩替卡韋高劑量組，給藥5天后血清學(xué)HBV DNA表達(dá)水平隨即出現(xiàn)明顯下降，與同一天生理鹽水組對比差異存在統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。給藥10天后下降仍然明顯，與同一天生理鹽水組對比差異存在統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。 拉米夫定低劑量組給藥10天后血清學(xué)HBV DNA下降明顯，與同一天生理鹽水組對比差異存在統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），停藥15天后出現(xiàn)明顯回復(fù)，與該組給藥10天時對比差異存在統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。拉米夫定高劑量組給藥10天后下降明顯，與同一天生理鹽水組對比差異存在統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。 3.藥物處理對小鼠血清HBeAg、HBsAg表達(dá)的影響 實驗全程第0天、給藥10天、停藥15天對各組小鼠血清學(xué)HBeAg、HBsAg表達(dá)水平檢測，恩替卡韋高、低劑量組，拉米夫定高、低劑量組，空白對照組、生理鹽水組均無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論 對免疫力正常的C57BL/6小鼠注射rAAV8-1.3HBV病毒后，小鼠體內(nèi)高水平表達(dá)HBV DNA、HBsAg、HBeAg，利用rAAV8-1.3HBV病毒可成功制備rAAV8-1.3HBV介導(dǎo)的HBV慢性感染小鼠模型，模型具有制備簡單、成模率高、表達(dá)穩(wěn)定均一的特點(diǎn)。對該模型應(yīng)用核苷酸類似物后，小鼠血清HBVDNA表達(dá)水平顯著下降，而HBeAg、HBsAg表達(dá)水平未見明顯改變。rAAV8-1.3HBV介導(dǎo)的慢性感染小鼠模型，客觀真實地反應(yīng)了現(xiàn)有核苷酸類似物的抗HBV效果，可以作為新的抗HBV核苷酸類似物藥物篩選評價模型應(yīng)用。
【關(guān)鍵詞】：乙型肝炎病毒 rAAV8-1.3HBV 小鼠模型 藥物評價
【學(xué)位授予單位】：濟(jì)南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R-332;R373.21
【目錄】：

• 摘要8-11
• Abstract11-15
• 主要符號表15-16
• 前言16-19
• 材料和方法19-30
• 1 實驗材料19-21
• 1.1 重組腺相關(guān)病毒19
• 1.2 實驗小鼠19
• 1.3 藥物19
• 1.4 主要試劑19-20
• 1.5 主要儀器20-21
• 1.6 主要試劑的配制21
• 2 實驗方法及步驟21-27
• 2.1 重組病毒 rAAV8-1.3HBV 的制備21-22
• 2.2 熒光定量 PCR 檢測血清學(xué) HBV DNA 表達(dá)水平步驟22-24
• 2.3 HBeAg 定性檢測方法24-26
• 2.4 HBsAg 定性檢測方法26-27
• 2.5 HBeAg 定量檢測方法27
• 2.6 HBsAg 定量檢測方法27
• 3 動物處理及分組27-29
• 3.1 動物模型的建立27-28
• 3.2 動物模型的篩選28
• 3.3 動物分組及處理情況28-29
• 4 統(tǒng)計學(xué)方法29-30
• 結(jié)果30-39
• 1 小鼠成模情況30-33
• 1.1 血清學(xué) HBeAg 和 HBsAg 定性檢測結(jié)果30
• 1.2 血清學(xué) HBV DNA 的表達(dá)情況30-31
• 1.3 血清學(xué) HBeAg 和 HBsAg 定量檢測結(jié)果31-33
• 2 藥物處理對小鼠模型血清學(xué) HBV DNA 表達(dá)水平的影響33-36
• 2.1 ETV 對小鼠模型血清學(xué) HBV DNA 表達(dá)水平的影響33-34
• 2.2 LAM 對小鼠模型血清學(xué) HBV DNA 表達(dá)水平的影響34-36
• 3 藥物處理對小鼠模型血清學(xué) HBeAg、HBsAg 表達(dá)水平的影響36-39
• 討論39-45
• 一、評價小鼠模型的成模情況41
• 二、核苷類似物對小鼠模型血清 HBV DNA 表達(dá)的影響41-42
• 三、核苷類似物對小鼠模型血清 HBeAg、HBsAg 表達(dá)的影響42-45
• 結(jié)論45-46
• 參考文獻(xiàn)46-50
• 附圖50-53
• 綜述53-61
• 參考文獻(xiàn)59-61
• 攻讀學(xué)位期間取得的研究成果61-62
• 一．攻讀碩士學(xué)位期間參與的科研工作61
• 二．攻讀碩士學(xué)位期間已發(fā)論文61-62
• 致謝62

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前7條

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本文編號：513289