本文關鍵詞：rAAV8-1.3HBV介導的HBV慢性感染—小鼠藥物評價模型的建立

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【摘要】：目的 乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV），是引起人類急慢性肝炎的主要病原體之一。全球約1/3的人曾感染HBV，我國屬于HBV感染的高流行區(qū)，乙型肝炎表面抗原（Hepatitis B surface antigen，HBsAg）陽性率接近10%。目前，對HBV的研究主要以應用HBV相關的動物模型為主，又以小鼠模型應用最為廣泛。現階段常用于HBV研究的小鼠模型包括：轉基因小鼠模型和水動力質粒法構建的HBV小鼠模型。但這兩種模型均因各自存在缺陷，使得應用受到限制。 2010年本課題組制備出攜帶1.3拷貝HBV基因組（ayw亞型）的重組8型腺相關病毒（rAAV8-1.3HBV），尾靜脈注射C57BL/6小鼠后，初步檢測到病毒在小鼠體內持續(xù)成功表達。為進一步評價該方法制備小鼠模型的成模情況，探索該模型是否可作為新的抗HBV藥物篩選和評價的動物模型，故進行此實驗。 方法 1.模型的建立及評價 選取4到6周齡雄性C57BL/6小鼠30只，按照1×1011vg劑量，尾靜脈注射rAAV8-1.3HBV病毒至30只小鼠體內。病毒注射后第2周、第4周定性檢測血清學HBeAg、HBsAg的表達情況，第6周定量檢測血清學HBV DNA、HBeAg、HBsAg的表達情況。結合血清學定量、定性檢測結果，在30只小鼠中選取建模成功的小鼠用于后續(xù)實驗。 2.藥物實驗的分組及給藥策略 將建模成功的rAAV8-1.3HBV介導的慢性感染小鼠隨機分為恩替卡韋高、低劑量組，拉米夫定高、低劑量組，生理鹽水組及空白對照組，采用灌胃給藥的方式，給藥10天后停藥15天。 3.藥效的評價指標 實驗過程中給藥5天、給藥10天、停藥15天三個時間點分別定量檢測小鼠血清學HBV DNA、HBeAg、HBsAg的表達水平。對比給藥前后、停藥前后小鼠血清學HBV DNA、HBeAg、HBsAg的變化情況，采用統計學分析，最終得出結論。 4.各指標檢測方法 血清學HBV DNA的表達情況采用熒光定量PCR方法檢測，HBeAg和HBsAg的表達情況采用定性、定量ELISA方法檢測。 結果 1.小鼠成模情況評價 1.1ELISA定性檢測結果病毒注射第14天檢測小鼠血清學HBeAg和HBsAg表達水平顯示，30只小鼠中28只HBeAg表達為陽性，HBsAg全部表達為陽性；第28天檢測結果顯示，29只建模小鼠HBeAg表達陽性，HBsAg全部表達為陽性。 1.2HBV DNA定量檢測結果病毒注射第42天檢測小鼠血清學HBV DNA(lg (IU/mL))的表達情況顯示，，30只小鼠中27只HBV DNA表達大于5.0。 1.3ELISA定量檢測結果病毒注射第42天檢測小鼠血清學HBeAg和HBsAg表達水平顯示，除3只小鼠HBeAg、HBsAg表達相對較低，其余27只小鼠血清HBeAg平均值13.22±1.78S/CO，HBsAg平均值93.24±7.24mIU/mL。 結合HBV DNA表達水平及ELISA定性、定量結果，最終選取27只小鼠作為后續(xù)模型使用，建模成功率達90%。 2.藥物處理對小鼠模型血清HBV DNA表達的影響 對模型小鼠應用核苷酸類似物后觀察到，恩替卡韋低劑量組給藥10天后血清學HBV DNA表達水平下降明顯，與同一天生理鹽水組對比差異存在統計學意義（P＜0.05），停藥15天后明顯回復，與該組給藥10天時對比差異存在統計學意義（P＜0.05）。恩替卡韋高劑量組，給藥5天后血清學HBV DNA表達水平隨即出現明顯下降，與同一天生理鹽水組對比差異存在統計學意義（P＜0.01）。給藥10天后下降仍然明顯，與同一天生理鹽水組對比差異存在統計學意義（P＜0.01）。 拉米夫定低劑量組給藥10天后血清學HBV DNA下降明顯，與同一天生理鹽水組對比差異存在統計學意義（P＜0.05），停藥15天后出現明顯回復，與該組給藥10天時對比差異存在統計學意義（P＜0.05）。拉米夫定高劑量組給藥10天后下降明顯，與同一天生理鹽水組對比差異存在統計學意義（P＜0.05）。 3.藥物處理對小鼠血清HBeAg、HBsAg表達的影響 實驗全程第0天、給藥10天、停藥15天對各組小鼠血清學HBeAg、HBsAg表達水平檢測，恩替卡韋高、低劑量組，拉米夫定高、低劑量組，空白對照組、生理鹽水組均無明顯變化，差異無統計學意義。 結論 對免疫力正常的C57BL/6小鼠注射rAAV8-1.3HBV病毒后，小鼠體內高水平表達HBV DNA、HBsAg、HBeAg，利用rAAV8-1.3HBV病毒可成功制備rAAV8-1.3HBV介導的HBV慢性感染小鼠模型，模型具有制備簡單、成模率高、表達穩(wěn)定均一的特點。對該模型應用核苷酸類似物后，小鼠血清HBVDNA表達水平顯著下降，而HBeAg、HBsAg表達水平未見明顯改變。rAAV8-1.3HBV介導的慢性感染小鼠模型，客觀真實地反應了現有核苷酸類似物的抗HBV效果，可以作為新的抗HBV核苷酸類似物藥物篩選評價模型應用。
【關鍵詞】：乙型肝炎病毒 rAAV8-1.3HBV 小鼠模型 藥物評價
【學位授予單位】：濟南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R-332;R373.21
【目錄】：

• 摘要8-11
• Abstract11-15
• 主要符號表15-16
• 前言16-19
• 材料和方法19-30
• 1 實驗材料19-21
• 1.1 重組腺相關病毒19
• 1.2 實驗小鼠19
• 1.3 藥物19
• 1.4 主要試劑19-20
• 1.5 主要儀器20-21
• 1.6 主要試劑的配制21
• 2 實驗方法及步驟21-27
• 2.1 重組病毒 rAAV8-1.3HBV 的制備21-22
• 2.2 熒光定量 PCR 檢測血清學 HBV DNA 表達水平步驟22-24
• 2.3 HBeAg 定性檢測方法24-26
• 2.4 HBsAg 定性檢測方法26-27
• 2.5 HBeAg 定量檢測方法27
• 2.6 HBsAg 定量檢測方法27
• 3 動物處理及分組27-29
• 3.1 動物模型的建立27-28
• 3.2 動物模型的篩選28
• 3.3 動物分組及處理情況28-29
• 4 統計學方法29-30
• 結果30-39
• 1 小鼠成模情況30-33
• 1.1 血清學 HBeAg 和 HBsAg 定性檢測結果30
• 1.2 血清學 HBV DNA 的表達情況30-31
• 1.3 血清學 HBeAg 和 HBsAg 定量檢測結果31-33
• 2 藥物處理對小鼠模型血清學 HBV DNA 表達水平的影響33-36
• 2.1 ETV 對小鼠模型血清學 HBV DNA 表達水平的影響33-34
• 2.2 LAM 對小鼠模型血清學 HBV DNA 表達水平的影響34-36
• 3 藥物處理對小鼠模型血清學 HBeAg、HBsAg 表達水平的影響36-39
• 討論39-45
• 一、評價小鼠模型的成模情況41
• 二、核苷類似物對小鼠模型血清 HBV DNA 表達的影響41-42
• 三、核苷類似物對小鼠模型血清 HBeAg、HBsAg 表達的影響42-45
• 結論45-46
• 參考文獻46-50
• 附圖50-53
• 綜述53-61
• 參考文獻59-61
• 攻讀學位期間取得的研究成果61-62
• 一．攻讀碩士學位期間參與的科研工作61
• 二．攻讀碩士學位期間已發(fā)論文61-62
• 致謝62

【參考文獻】

中國期刊全文數據庫 前7條

1 郭燕菊;王文;孫世惠;曾道炳;趙光宇;于虹;郭彥;譚文杰;盧實春;周育森;;免疫抑制劑地塞米松可明顯延長乙型肝炎病毒抗原在水動力法轉染HBV小鼠模型中的表達[J];病毒學報;2010年01期

2 董小巖;尉遲捷;王剛;田文洪;陸月;張風衛(wèi);王文;王岳;譚文杰;吳小兵;;高嗜肝性8型重組腺相關病毒體內轉導法制備乙型肝炎病毒持續(xù)感染小鼠模型[J];病毒學報;2010年06期

3 李平;于益芝;;乙型肝炎病毒感染的小鼠模型[J];國際流行病學傳染病學雜志;2006年06期

4 閆兆平;張琳;;核苷類似物治療慢性乙型肝炎研究進展[J];國際消化病雜志;2009年02期

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7 莊輝;;乙型肝炎流行病學研究進展[J];中國醫(yī)學前沿雜志(電子版);2009年02期

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