本文關(guān)鍵詞：尿激酶型纖溶酶原激活物生物傳感器的構(gòu)建及鑒定

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【摘要】：背景/目的:構(gòu)建含有增強(qiáng)型青色熒光蛋白(ECFP)-尿激酶型纖溶酶原激活物(u PA)作用底物(substrate)-黃色熒光蛋白變體(YPet)的真核表達(dá)載體(ECFP-u PA substrate-linker-YPet),即uPA的生物傳感器(uPAbiosensor)。方法:以現(xiàn)有質(zhì)粒Src-biosensor為模板,Primer 5.0軟件設(shè)計YPet引物,設(shè)計時5'端引入u PA底物序列及Linker,兩端連接酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基。以p MDTM-18T為中間載體,通過基因工程方法構(gòu)建含有ECFP-u PA substrate-linker-YPet的真核表達(dá)載體。并進(jìn)行PCR,雙酶切和測序鑒定,然后轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,24h后在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率和融合蛋白表達(dá)情況,并用重組人u PA(rhu PA)刺激轉(zhuǎn)染細(xì)胞,應(yīng)用Meta Flour FRET 4.6軟件觀察并測量u PA生物傳感器熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)。結(jié)果:經(jīng)過PCR和雙酶切鑒定,克隆片段和酶切片段均與u PA substrate分子大小相符;將u PA biosensor轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染效率達(dá)40%,并在FRET通道觀察到了FRET現(xiàn)象,說明u PA biosensor融合蛋白在活細(xì)胞中得到表達(dá),并且用免疫組化方法證明了u PA biosensor的膜表達(dá);rhu PA刺激轉(zhuǎn)染細(xì)胞可以檢測到FRET現(xiàn)象變化,即在活細(xì)胞中證明了u PA biosensor構(gòu)建成功。結(jié)論:u PA生物傳感器已經(jīng)構(gòu)建成功,該生物傳感器能夠作為活細(xì)胞分子探針研究u PA的時空變化。
【關(guān)鍵詞】：尿激酶型纖溶酶原激活物 生物傳感器 熒光共振能量轉(zhuǎn)移 骨性關(guān)節(jié)炎
【學(xué)位授予單位】：石河子大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R684.3
【目錄】：

• 中文摘要6-7
• 英文摘要7-8
• 英文縮略詞8-9
• 前言9-14
• 材料與方法14-25
• 1.材料14-16
• 1.1 菌株，細(xì)胞和質(zhì)粒14-15
• 1.2 主要試劑和酶類15
• 1.3 主要儀器15-16
• 2.主要技術(shù)路線圖16
• 3.方法16-25
• 結(jié)果25-41
• 1 u PA-biosensor質(zhì)粒的主要部分結(jié)構(gòu)示意圖25
• 2 PCR基因的克隆25-26
• 3 u PA-biosensor質(zhì)粒PCR及雙酶切鑒定26-29
• 4 測序結(jié)果29-37
• 5 轉(zhuǎn)染細(xì)胞u PA biosensor的表達(dá)37-39
• 6 rhu PA刺激轉(zhuǎn)染細(xì)胞的FRET現(xiàn)象39-41
• 討論41-44
• 結(jié)論44-45
• 參考文獻(xiàn)45-49
• 文獻(xiàn)綜述49-56
• 參考文獻(xiàn)54-56
• 致謝56-57
• 作者簡介57-58
• 導(dǎo)師評閱表58

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