本文關(guān)鍵詞：乙肝可復(fù)制型DNA疫苗低電壓電穿孔遞送與免疫活性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：DNA疫苗在治療性疫苗研究領(lǐng)域的地位至關(guān)重要。關(guān)于DNA疫苗體內(nèi)遞送的研究發(fā)展很快，從最初的直接注射到基因槍接種，再發(fā)展到新近出現(xiàn)的電穿孔技術(shù)，質(zhì)粒DNA的體內(nèi)遞送效率顯著提高，這為DNA疫苗快速發(fā)展和應(yīng)用提供了有力的技術(shù)支持。其中電穿孔遞送兼?zhèn)涓咝�、安全、操作簡便和低成本等多項特質(zhì)，成為DNA疫苗遞送的首選方案，但關(guān)于電穿孔遞送條件的深入研究目前還有待進步完善。 當(dāng)前文獻報道電穿孔遞送DNA疫苗的常用脈沖電壓多集中在180v-900v的高壓區(qū)。在實際應(yīng)用中我們發(fā)現(xiàn)高電壓遞送DNA疫苗質(zhì)粒，會對組織細胞造成定損傷；隨著免疫接種次數(shù)的增多，DNA疫苗在局部壞死組織的體內(nèi)遞送量也會逐漸降低；而且臨床試驗時，患者對高電壓也會產(chǎn)生定恐懼不利于DNA疫苗的推廣應(yīng)用；所以本研究擬進步探討低電壓下遞送DNA疫苗的可行性。 首先，本研究選取攜帶螢火蟲熒光素酶報告基因的三種不同類型表達質(zhì)粒，作為我們研究體內(nèi)電穿孔遞送的模式質(zhì)粒。它們分別是：①pGL3-CMV，為本室前期保存，帶有螢火蟲熒光素酶報告基因的完整表達框，分子量約為5kb，可以作為小分子量質(zhì)粒的代表；②pEE14.1-luc，為本研究自主構(gòu)建，由于基礎(chǔ)載體分子量較大約為11kb，該質(zhì)粒構(gòu)建成功后分子量可達12.5kb，可以作為大分子量質(zhì)粒的代表；③pSVK-luc，也是本研究自主構(gòu)建的表達質(zhì)粒，載體pSVK是基于塞姆利基森林病毒Semliki Forestvirus (SFV)改構(gòu)而成的可復(fù)制型表達載體，其表達特性與傳統(tǒng)DNA質(zhì)粒有顯著不同，該質(zhì)粒分子量約為13kb，可以作為復(fù)制子DNA疫苗質(zhì)粒的代表。重組質(zhì)粒pEE14.1-luc和pSVK-luc的構(gòu)建，以質(zhì)粒pGL3-CMV為模板擴增熒光素酶報告基因，然后克隆入pEE14.1和pSVK載體中構(gòu)建而成，并采用Western blot、流式細胞術(shù)，免疫熒光和活體成像技術(shù)檢測重組質(zhì)粒在體內(nèi)外的表達情況。結(jié)果顯示重組質(zhì)粒pEE14.1-luc和pSVK-luc在體內(nèi)外均獲得高效表達。 其次，將pGL3-CMV、pEE14.1-luc和pSVK-luc作為模式質(zhì)粒，以1μg和50μg兩個劑量分別接種BALB/c小鼠左右腿部肌肉，再在低電壓范圍內(nèi)選取30V、60V和120V三個脈沖電壓進行刺激，接種后48h活體成像儀檢測小鼠股四頭肌內(nèi)熒光素酶表達量。兩次接種后，剝離不同脈沖電壓刺激后的小鼠股四頭肌肉組織進行HE染色觀察肌肉組織的纖維結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示：①各質(zhì)粒在高劑量50μg電穿孔遞送時，60V和120V脈沖電壓刺激下DNA遞送量顯著高于30V遞送，但60V和120V的DNA遞送量無顯著性差異；在120V電壓刺激后，HE染色檢測發(fā)現(xiàn)肌肉組織纖維出現(xiàn)明顯斷裂，溶脹，而在較低電壓組60V和30V的電壓刺激下未出現(xiàn)明顯組織纖維損傷，綜合比較，初步推斷60V低電壓下遞送三種類型質(zhì)粒DNA的表達效果均較優(yōu)，且局部組織細胞也無明顯損傷；②各質(zhì)粒在低劑量1μg電穿孔遞送時，結(jié)果發(fā)現(xiàn)常規(guī)DNA質(zhì)粒pGL3-CMV、pEE14.1-luc均未檢測到熒光素酶基因表達，但可復(fù)制型大分子質(zhì)粒pSVK-luc在60V、120V脈沖電壓遞送下可見熒光素酶表達，初步推論可復(fù)制型質(zhì)粒在低劑量下接種存在定的優(yōu)勢。 最后，為進步驗證低電壓下遞送DNA疫苗在實際應(yīng)用中的可行性，以本室前期構(gòu)建的乙肝可復(fù)制型DNA疫苗pSVK-HBVA及常規(guī)小分子DNA疫苗pVAX1-HBVA為研究對象，分別設(shè)立兩種疫苗的高（100μg）中（10μg）低（1μg）三個劑量組，免疫接種BALB/c小鼠，并在60v的低電壓下進行電穿孔遞送，分別檢測兩種DNA疫苗在小鼠體內(nèi)的體液免疫和細胞免疫應(yīng)答。結(jié)果顯示：1、低電壓（60V）遞送乙肝DNA疫苗在體內(nèi)激起較強的細胞與體液免疫應(yīng)答;2、60V電壓三次免疫接種過程順利，未見BALB/c小鼠股四頭肌肌肉組織僵硬現(xiàn)象，保證多次免疫遞送的成功；3，雖抗體滴度呈定的劑量依賴即隨著免疫劑量的升高，抗體滴度也逐步升高，但復(fù)制子DNA疫苗pSVK-HBVA在常規(guī)DNA疫苗1/100的劑量下，即可激活高效的細胞免疫應(yīng)答，顯示出良好應(yīng)用潛質(zhì)。 綜上所述，本研究以pGL3-CMV、pEE14.1-luc、pSVK-luc為模式質(zhì)粒，初步驗證低電壓(60V)遞送DNA疫苗可行，又以低脈沖電壓（60V）遞送本室前期構(gòu)建乙肝可復(fù)制型DNA疫苗pSVK-HBVA和常規(guī)乙肝DNA疫苗pVAX1-HBVA，證實低電壓電穿孔遞送上述疫苗可激活體內(nèi)高水平的免疫應(yīng)答，且乙肝可復(fù)制子DNA疫苗在常規(guī)DNA疫苗1/100的劑量下，即可激活高效的細胞免疫應(yīng)答，揭示了乙肝可復(fù)制型DNA疫苗的良好應(yīng)用前景和潛質(zhì)；同時，，進步驗證DNA疫苗電穿孔低電壓體內(nèi)遞送的可行性，為DNA疫苗電穿孔免疫遞送提供重要參考數(shù)據(jù)更為電穿孔技術(shù)的臨床應(yīng)用奠定實驗基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：乙肝可復(fù)制型DNA疫苗 熒光素酶基因 電穿孔遞送 活體成像技術(shù) 細胞免疫 體液免疫
【學(xué)位授予單位】：新疆大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R392
【目錄】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-11
• 英文縮略語11-16
• 第一部分 前言16-24
• 參考文獻20-24
• 第二部分 實驗部分24-67
• 第一章 熒光素酶表達質(zhì)粒 pEE14.1-luc 和 pSVK-luc 的構(gòu)建與表達24-48
• 1. 材料與方法24-39
• 1.1 材料24-25
• 1.1.1 菌株與載體24
• 1.1.2 化學(xué)試劑和酶24-25
• 1.1.3 實驗動物和主要儀器設(shè)備25
• 1.2 方法25-34
• 1.2.1 pSVK-luc、pEE14.1-luc 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定25-30
• 1.2.1.1 pSVK-luc 重組質(zhì)粒的構(gòu)建25-26
• 1.2.1.2 PCR 回收產(chǎn)物與 pMDl8-simple-T 載體的連接反應(yīng)26-27
• 1.2.1.3 大腸桿菌(E.coli)DH5α感受態(tài)細胞的制備27
• 1.2.1.4 大腸桿菌(E. coil)DH5α的轉(zhuǎn)化27-28
• 1.2.1.5 重組質(zhì)粒 pMD18-simple-T-luc 的篩選與鑒定28-29
• 1.2.1.5.1 重組質(zhì)粒 pMD18-simple-T-luc 的菌液 PCR 鑒定28
• 1.2.1.5.2 重組質(zhì)粒 pMD18-simple-T-luc 的酶切鑒定28-29
• 1.2.1.5.3 重組質(zhì)粒 pMD18-simple-T-luc 的 DNA 測序分析29
• 1.2.1.6 重組質(zhì)粒 pSVK-luc 的構(gòu)建29-30
• 1.2.1.6.1 基于塞姆利基森林病毒復(fù)制子載體 pSVK 空載體的酶切鑒定29-30
• 1.2.1.6.2 重組質(zhì)粒 pSVK-luc 構(gòu)建30
• 1.2.1.6.3 重組表達質(zhì)粒 pSVK-luc 的轉(zhuǎn)化和鑒定30
• 1.2.2 重組質(zhì)粒 pEE14.1-luc 的構(gòu)建30-34
• 1.2.2.1 熒光素酶基因片段（luc）的獲得30-32
• 1.2.2.2 熒光素酶基因（luc）片段與 pEE14.1 載體的連接32-34
• 1.3 體外檢測熒光素酶基因的表達34-37
• 1.3.1 293T 細胞的培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染34-35
• 1.3.1.1 293T 細胞的傳代培養(yǎng)34
• 1.3.1.2 293T 細胞的培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染34-35
• 1.3.2 western blot 檢測 pSVK-luc、pEE14.1-luc 在細胞內(nèi)表達的檢測35-36
• 1.3.3 流式細胞術(shù)及免疫熒光法體外檢測熒光素酶基因的表達36-37
• 1.4 活體成像技術(shù)檢測重組質(zhì)粒 pSVK -luc、pEE14.1-luc 活體內(nèi)表達37-39
• 1.4.1 免疫用質(zhì)粒 pSVK -luc、pEE14.1-luc、pGL3-CMV 的大量提取37-38
• 1.4.2 動物免疫方案38-39
• 2. 結(jié)果39-44
• 2.1 熒光素酶基因 luc 的克隆39
• 2.2 熒光素酶基因 luc 片段的回收39
• 2.3 重組質(zhì)粒 pMD18-sample-T-luc 的鑒定39-41
• 2.3.1 重組質(zhì)粒 pMD18-sample-T-luc 的 PCR 鑒定39-40
• 2.3.2 重組 pMD18-sample-T-luc 載體的酶切鑒定40
• 2.3.3 重組質(zhì)粒 DNA pMD18-sample-T-luc 的測序分析40-41
• 2.4 塞姆利基森林病毒復(fù)制子載體（pSVK 空載體）的酶切鑒定41-42
• 2.4.1 重組質(zhì)粒 pSVK-luc、pEE14.1-luc 的鑒定41-42
• 2.4.1.1 重組質(zhì)粒 pSVK-luc、pEE14.1-luc 的 PCR 鑒定41-42
• 2.4.1.2 重組 pSVK-luc 載體的酶切鑒定42
• 2.4.1.3 重組質(zhì)粒 pSVK-luc、pEE14.1-luc 的測序鑒定42
• 2.5 Western blot 體外檢測熒光素酶基因的表達42-43
• 2.6 流式細胞術(shù)、免疫熒光體外檢測熒光素酶基因的表達43-44
• 2.6.1 流式細胞術(shù)檢測熒光素酶基因的表達43
• 2.6.2 免疫熒光法體外檢測熒光素酶基因的表達43-44
• 2.7 活體成像技術(shù)檢測重組質(zhì)粒 pSVK-luc、pEE14.1-luc 體內(nèi)表達44
• 3. 討論44-47
• 參考文獻47-48
• 第二章 低電壓電穿孔體內(nèi)遞送疫苗質(zhì)粒條件的初步研究48-58
• 1、材料與方法48-52
• 1.1 材料48
• 1.1.1 質(zhì)粒、實驗動物及主要試劑48
• 1.1.2 主要儀器設(shè)備48
• 1.2 方法48-52
• 1.2.1 pGL3-CMV，pSVK-luc 和 pEE14.1-luc 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化48-49
• 1.2.2 pGL3-CMV，pSVK-luc 和 pEE14.1-luc 質(zhì)粒的大量提取49-50
• 1.2.3 重組質(zhì)粒 pGL3-CMV、pSVK-luc 和 pEE14.1-luc 的酶切鑒定50-51
• 1.2.4 動物實驗分組及 DNA 免疫策略51
• 1.2.5 Xenogen 成像系統(tǒng)檢測螢光素酶在小鼠體內(nèi)的表達51-52
• 1.2.6 蘇木精-伊紅（HE）染色檢測 BALB/c 小鼠大腿肌肉纖維結(jié)構(gòu)52
• 1.2.7 統(tǒng)計學(xué)處理52
• 2．結(jié)果52-54
• 2.1 重組質(zhì)粒 pGL3-CMV，pSVK-luc 和 pEE14.1-luc 的酶切鑒定52
• 2.2 熒光素酶基因小鼠股四頭肌內(nèi)的表達量檢測52-53
• 2.3 蘇木精-伊紅（HE）染色法檢測 BALB/c 小鼠大腿肌肉纖維結(jié)構(gòu)53-54
• 3. 討論54-56
• 參考文獻56-58
• 第三章 低電壓體內(nèi)遞送乙肝 DNA 疫苗的初步藥效學(xué)分析58-67
• 1 材料和方法58-59
• 1.1 材料58-59
• 1.1.1 質(zhì)粒及實驗動物58
• 1.1.2 主要試劑及檢測試劑盒58
• 1.1.3 主要的儀器設(shè)備58-59
• 2 方法59-62
• 2.1 免疫用質(zhì)粒的大量提取與純化59
• 2.2 實驗動物分組及免疫策略59
• 2.3 乙肝治療性疫苗 pVAX-HBVA、pSVK-HBVA 的免疫活性研究59-62
• 2.3.1 ELISA 定量檢測 BALB/c 小鼠血清中抗 HBcAg 抗體59-60
• 2.3.2 ELISPOT 檢測 BALB/c 小鼠 IFN-γ分泌細胞數(shù)60-62
• 2.3.2.1 免疫小鼠脾臟單細胞懸液的制備60
• 2.3.2.2 ELISPOT 法檢測免疫小鼠脾細胞 IFN-γ分泌細胞數(shù)60-61
• 2.3.2.3 CCK-8 法檢測免疫小鼠脾臟淋巴細胞增殖61-62
• 2.4 統(tǒng)計學(xué)處理62
• 3. 結(jié)果62-64
• 3.1 ELISA 定量檢測 BALB/c 小鼠血清中抗 HBcAg 抗體62
• 3.2 ELISPOT 檢測免疫小鼠 IFN-γ分泌細胞數(shù)62-63
• 3.3 CCK8 檢測免疫小鼠脾臟淋巴細胞增殖63-64
• 4 討論64-66
• 參考文獻66-67
• 第三部分 結(jié)論與展望67-69
• 第四部分 附錄69-72
• 附錄一 碩士期間參加的研究課題和發(fā)表論文69-70
• 附錄二 個人簡歷70-72
• 致謝72-73

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本文編號：508173