本文關(guān)鍵詞：小鼠FcRn介導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)禽流感抗原的粘膜免疫研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：高致病性禽流感不僅對養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失,而且也感染人,嚴(yán)重威脅人類的健康。禽流感病毒主要通過粘膜感染人體,因此預(yù)防禽流感最理想的免疫途徑就是通過粘膜免疫,因?yàn)槠は禄蚣∪庾⑸湟话阒灰鸱浅Ｎ⑷醯恼衬っ庖叻磻?yīng),而通過粘膜免疫接種模擬了病毒的自然感染途徑,可以同時產(chǎn)生有效地局部粘膜免疫反應(yīng)和全身性的系統(tǒng)免疫反應(yīng)。鑒于FcRn可以介導(dǎo)IgG跨越粘膜屏障,我們以小鼠為模型設(shè)計(jì)禽流感H5N1HA1與小鼠IgG Fc片段融合,模擬FcRn介導(dǎo)IgG轉(zhuǎn)運(yùn)的胞轉(zhuǎn)通路開展了禽流感的粘膜免疫研究。 在本課題組的前期研究中,已構(gòu)建了原核表達(dá)重組質(zhì)粒KG-HA1, pET-32a-HA1-wFc與桿狀病毒真核表達(dá)重組質(zhì)粒pFASTBAC HTb-sHA1-wFc和pFASTBAC HTb-sHA1-mFco HA1-wFc是HA1和IgG2a Fc野生型片段的融合基因,sHA1-wFc是加了信號肽的HA1和IgG2a Fc野生型片段的融合基因,sHA1-mFc是sHA1和IgG2a Fc突變型片段的融合基因。 本研究主要成果如下： 1.表達(dá)并純化了四種HA1融合蛋白：GST-HA1, His-HA1-wFc(原核表達(dá)),His-sHA1-wFc(真核表達(dá),簡稱sHA1-wFc)和His-sHA1-mFc(真核表達(dá),簡稱sHA1-mFc)。其分子量分別為62KDa,87KDa,72KDa和72KDa。 2.在IMCD-rFcRn細(xì)胞系的體外胞轉(zhuǎn)模型中,FcRn能介導(dǎo)sHA1-wFc融合蛋白從細(xì)胞的頂端側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)到基底膜端側(cè),而sHA1-mFc融合蛋白和His-HA1-wFc融合蛋白均不能被胞轉(zhuǎn)；在體內(nèi)sHA1-wFc融合蛋白能有效的跨越小鼠呼吸道粘膜上皮進(jìn)入血液中,與sHA1-mFc和GST-HA1融合蛋白進(jìn)入小鼠血液中的量相比差異極顯著(P0.01)。 3. sHA1-wFc融合蛋白經(jīng)滴鼻免疫既能誘導(dǎo)有效的粘膜免疫反應(yīng),又能誘導(dǎo)全身性免疫反應(yīng)：(1)二免后第10d在sHA1-wFc滴鼻免疫組小鼠的氣管與肺臟沖洗液中,SIgA的ELISA抗體效價(jià)分別為1：117和1：64,IgG的ELISA抗體效價(jià)分別為1：298和1：462,與其它滴鼻免疫組相比差異極顯著(P0.01)。而sHA1-wFc皮下免疫組SIgA的ELISA抗體效價(jià)分別僅為和1：10和1：13,IgG的ELISA抗體效價(jià)均為1：58。sHA1-wFc滴鼻免疫組與皮下免疫組相比差異極顯著(P0.01)。用HI法沒有檢測到IgG抗體效價(jià)。(2)二免后第14d sHA1-wFc滴鼻免疫組IgG的ELISA抗體和HI抗體水平最高,ELISA抗體效價(jià)達(dá)到1：9386,HI抗體效價(jià)達(dá)到1：46,與其它滴鼻免疫組相比差異極顯著(P0.01)；同樣,在二免后第14d sHA1-wFc皮下免疫組IgG的ELISA抗體和HI抗體水平最高,ELISA抗體效價(jià)達(dá)到1：18773,HI抗體效價(jià)達(dá)到1：80,與sHA1-wFc滴鼻免疫組相比差異極顯著(P0.01)。(3)二免后第10d sHA1-wFc滴鼻免疫組血清中IFN-γ和IL-2含量分別達(dá)到330pg/mL和106pg/mL,與其它滴鼻免疫組相比差異極顯著(P0.01)。sHA1-wFc皮下免疫組血清中IFN-γ和IL-2含量分別達(dá)到178pg/mL和72pg/mL, sHA1-wFc滴鼻免疫組與皮下免疫組相比差異極顯著(P0.01)。(4)二免后第10d sHA1-wFc滴鼻免疫組小鼠脾細(xì)胞增殖指數(shù)為1.14,與其它滴鼻免疫組差異極顯著(P0.01)。sHA1-wFc皮下免疫組小鼠脾細(xì)胞增殖指數(shù)為1.36,與sHA1-wFc滴鼻免疫組相比差異顯著(P0.05)。(5)攻毒后第3d在sHA1-wFc免疫組(滴鼻或皮下注射)的肺臟中均未檢測到病毒的血凝活性,而在其它免疫組肺臟組織中均檢測到了病毒的血凝活性；HA1-wFc免疫組(滴鼻或皮下注射)體重下降不明顯,且很快恢復(fù)到正常體重,而其它免疫組小鼠體重下降明顯,下降幅度最高達(dá)25%；sHA1-wFc免疫組(滴鼻或皮下注射)攻毒保護(hù)率均為100%,而sHA1-mFc和His-HA1-wFc滴鼻免疫組小鼠保護(hù)率分別僅為40%和20%,空白對照組小鼠全部死亡。 sHA1-wFc融合蛋白輔以CpG ODN1826粘膜佐劑通過滴鼻免疫,利用FcRn介導(dǎo)的IgG胞轉(zhuǎn)通路能有效的轉(zhuǎn)運(yùn)禽流感抗原跨越小鼠呼吸道粘膜屏障進(jìn)入體內(nèi),既能誘導(dǎo)有效的粘膜免疫反應(yīng),又能誘導(dǎo)全身性免疫反應(yīng),能完全保護(hù)免疫小鼠抵抗致死性禽流感病毒的攻擊。
【關(guān)鍵詞】：H5N1HA1 sHA1-wFc FcRn 滴鼻免疫 IgG胞轉(zhuǎn)作用
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R392;S852.4
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 縮略語表10-12
• 1 文獻(xiàn)綜述12-22
• 1.1 粘膜免疫12-14
• 1.1.1 粘膜免疫系統(tǒng)12
• 1.1.2 粘膜組織中抗原的轉(zhuǎn)運(yùn)12-13
• 1.1.3 SIgA在粘膜免疫中的作用13
• 1.1.4 粘膜佐劑13-14
• 1.2 FcRn的研究進(jìn)展14-18
• 1.2.1 FcRn的發(fā)現(xiàn)14-15
• 1.2.2 FcRn的結(jié)構(gòu)15-16
• 1.2.3 FcRn與IgG的相互作用16-17
• 1.2.4 FcRn的胞轉(zhuǎn)功能17-18
• 1.2.5 FcRn的應(yīng)用18
• 1.3 禽流感疫苗的研究進(jìn)展18-22
• 1.3.1 禽流感18
• 1.3.2 禽流感病毒的結(jié)構(gòu)18-19
• 1.3.3 凝素蛋白(HA)19
• 1.3.4 禽流感的公共衛(wèi)生學(xué)意義19-20
• 1.3.5 人用禽流感疫苗研究進(jìn)展20-22
• 2 目的意義22-23
• 3 材料方法23-40
• 3.1 材料23-27
• 3.1.1 菌株、細(xì)胞、毒株、雞胚及實(shí)驗(yàn)動物23
• 3.1.2 質(zhì)粒與桿粒23
• 3.1.3 主要藥品與試劑23
• 3.1.4 主要儀器23-24
• 3.1.5 各種培養(yǎng)基的配制24
• 3.1.6 主要試劑的配制24-27
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法27-40
• 3.2.1 重組原核表達(dá)質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定27-29
• 3.2.2 原核表達(dá)蛋白的純化29-30
• 3.2.3 重組真核表達(dá)質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定30-33
• 3.2.4 HA1融合蛋白的血凝活性測定33
• 3.2.5 HA1融合蛋白的體外胞轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)33-34
• 3.2.6 HA1融合蛋白跨越小鼠呼吸道粘膜屏障的檢測34
• 3.2.7 滴鼻和皮下免疫效果的檢測34-40
• 4 結(jié)果40-52
• 4.1 蛋白的原核表達(dá)與鑒定40-42
• 4.1.1 GST-HA1融合蛋白的原核表達(dá)與鑒定40
• 4.1.2 His-HA1-wFc融合蛋白的原核表達(dá)及鑒定40-41
• 4.1.3 sHA1-wFc與sHA1-mFc融合蛋白的真核表達(dá)及鑒定41-42
• 4.2 蛋白的純化與鑒定42-44
• 4.2.1 GST-HA1融合蛋白的純化及鑒定42-43
• 4.2.2 His-HA1-wFc融合蛋白的純化及鑒定43
• 4.2.3 sHA1-wFc與sHA1-mFc融合蛋白的純化及鑒定43-44
• 4.3 HA1融合蛋白的血凝活性檢測44
• 4.4 HA1融合蛋白的體外胞轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)44-45
• 4.5 HA1融合蛋白跨越小鼠呼吸道粘膜屏障的檢測45-46
• 4.6 滴鼻與皮下免疫小鼠結(jié)果46-52
• 5 討論52-56
• 5.1 FcRn的作用52-54
• 5.2 CpG粘膜佐劑54
• 5.3 粘膜免疫疫苗54-56
• 6 結(jié)論56-57
• 參考文獻(xiàn)57-64
• 致謝64

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前6條

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  本文關(guān)鍵詞：小鼠FcRn介導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)禽流感抗原的粘膜免疫研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：501375