本文關(guān)鍵詞：間充質(zhì)干細(xì)胞的三維培養(yǎng)及其體外免疫抑制作用研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的 間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是一類(lèi)具有自我更新能力及多向分化潛能的非造血干細(xì)胞,它的多向分化潛能,造血支持功能,低免疫源性,免疫調(diào)節(jié)功能及再生功能,使其成為一種具有臨床應(yīng)用前景的祖/干細(xì)胞來(lái)源。近年來(lái),間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫抑制功能備受關(guān)注。國(guó)內(nèi)外眾多研究表明,成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞和臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞等不同組織來(lái)源的MSCs都具有免疫抑制功能,在體外可抑制B細(xì)胞和T細(xì)胞增殖和分化,抑制DC細(xì)胞成熟,抑制NK細(xì)胞活性等；在體內(nèi),MSCs對(duì)GVHD和自身免疫性疾病都具有顯著的治療作用。 作為胎兒組織來(lái)源的MSCs,胎肝間充質(zhì)干細(xì)胞(fetal liver derived mesenchymal stem cells, FL-MSCs)及胎兒骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(fetal bone marrow derived mesenchymal stem cells, FBM-MSCs)伴隨胎兒發(fā)育期間骨髓造血微環(huán)境的逐步形成。FL-MSCs及FBM-MSCs在自我更新、多向分化潛能和高度增殖等干細(xì)胞基本生物學(xué)特征方面,與成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞類(lèi)似。但是,目前關(guān)于這兩種細(xì)胞免疫學(xué)特性的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。對(duì)這兩種細(xì)胞免疫學(xué)特性的研究,可能有助于我們更深入的了解FL-MSCs及FBM-MSCs在胎兒造血微環(huán)境及造血發(fā)育調(diào)節(jié)等重要生理功能中的作用。 早期研究表明造血細(xì)胞的增殖和分化受骨髓微環(huán)境的調(diào)控,而骨髓微環(huán)境是一個(gè)三維立體的培養(yǎng)空間,基質(zhì)細(xì)胞是其中的重要組成部分,基質(zhì)細(xì)胞通過(guò)分泌細(xì)胞因子、細(xì)胞外基質(zhì)以及細(xì)胞與細(xì)胞之間的直接接觸來(lái)調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞的增殖與分化,維持造血干細(xì)胞的干性。然而大多數(shù)關(guān)于基質(zhì)細(xì)胞調(diào)控造血細(xì)胞生長(zhǎng)及自我更新能力的研究都是利用平面培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行的,而且大部分的結(jié)果顯示培養(yǎng)四至八周后,造血細(xì)胞即會(huì)開(kāi)始減少。這種造血支持缺陷是否能夠在三維培養(yǎng)體系中得到改善還缺乏進(jìn)一步研究,因此,我們建立了三維立體的培養(yǎng)系統(tǒng),研究臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord mesenchymal stem cells, UC-MSCs)在三維立體條件下的生物學(xué)特性變化,以便以后更好地研究三維立體條件下的造血擴(kuò)增及分化。 方法 1.間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定：原代培養(yǎng)人FBM-MSCs和FL-MSCs;通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表面分子的表達(dá),Alizarin Red S、Von Kossa及Oil RedO染色和LPL、OPN相關(guān)基因的表達(dá)檢測(cè)多向分化潛能。 2. FBM-MSCs及FL-MSCs的生長(zhǎng)特性：通過(guò)連續(xù)傳代觀察兩種細(xì)胞的生長(zhǎng)速度；觀察連續(xù)傳代后細(xì)胞形態(tài)變化,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)連續(xù)傳代后細(xì)胞表面分子的表達(dá)。 3. FBM-MSCs及FL-MSCs對(duì)PBMC增殖的影響：分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC);利用MSC/PBMC體外共培養(yǎng)體系,CFSE法檢測(cè)PBMC的增殖,ELISA法及RT-PCR檢測(cè)炎性細(xì)胞因子的蛋白分泌水平及mRNA表達(dá)水平;利用RT-PCR檢測(cè)該體系中FBM-MSCs及FL-MSCs共培養(yǎng)前后,多種免疫抑制性細(xì)胞因子分泌水平的變化。 4.細(xì)胞-細(xì)胞接觸在免疫抑制中的作用：Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞-細(xì)胞接觸的作用；RT-PCR檢測(cè)共培養(yǎng)體系中FBM-MSCs及FL-MSCs共培養(yǎng)前后粘附分子ICAM1, ICAM3和VCAM1的表達(dá)。 5. UC-MSCs的三維培養(yǎng)：從臍帶中分離出MSC,分別在二維及三維條件下培養(yǎng)；通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)MSC表面抗原的表達(dá)水平；通過(guò)成血管試驗(yàn)比較了兩種細(xì)胞的成血管能力；并通過(guò)RT-PCR檢測(cè)兩種培養(yǎng)條件下造血相關(guān)細(xì)胞因子的基因表達(dá)情況。 結(jié)果 1.成功地分離出了FBM-MSCs及FL-MSCs;我們所培養(yǎng)的胎兒骨髓和胎肝MSC均可旺盛增殖,呈現(xiàn)典型的成纖維樣梭行細(xì)胞形態(tài),高表達(dá)CD29、CD44、CD49e、 CD73、CD90、CD105,不表達(dá)造血細(xì)胞的表面標(biāo)記CD34、CD45,內(nèi)皮細(xì)胞的表面標(biāo)記CD31及GVHD相關(guān)的CD80、CD86、CD106、HLA-DR。此外兩種MSC低表達(dá)CD146、HLA-ABC;在誘導(dǎo)后可向成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化,并表達(dá)其特異性標(biāo)志。 2. FL-MSCs生長(zhǎng)速度較FBM-MSCs快；連續(xù)傳代以后兩種細(xì)胞仍保持間充質(zhì)干細(xì)胞的一些基本生物學(xué)特性。 3. FBM-MSCs及FL-MSCs對(duì)PBMC的增殖和炎性因子IFN-γ和TNF-α分泌具有明顯的抑制作用；共培養(yǎng)后,FBM-MSCs及FL-MSCs表達(dá)IDO、TSG-6和TGF-β的水平明顯提升。 4.細(xì)胞-細(xì)胞接觸在兩種細(xì)胞的免疫抑制中發(fā)揮重要作用；共培養(yǎng)后,FBM-MSCs及FL-MSCs表達(dá)ICAM1的水平明顯提升。 5.從臍帶中成功地分離出了MSC；在三維培養(yǎng)條件下其內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞和間充質(zhì)原始干細(xì)胞的表面標(biāo)記CD31、CD133和CD271等陽(yáng)性細(xì)胞百分比顯著增加,體外成血管能力增強(qiáng)；骨架蛋白β-Actin基因在三維培養(yǎng)條件下表達(dá)上調(diào),G-CSF、LIF、SCF、IL-lα、IL-1β、IL-3、IL-7和IL-11等與造血調(diào)控有關(guān)的細(xì)胞因子基因表達(dá)也有不同程度的增高,其中LIF、IL-3和IL-7升高尤為明顯；免疫調(diào)控相關(guān)的細(xì)胞因子IL-10的表達(dá)也增高；SDF-1和IL-6的表達(dá)雖有輕微的降低,但無(wú)顯著性差異。 結(jié)論 1.胎兒骨髓和胎肝均可獲得MSC,符合國(guó)際細(xì)胞治療協(xié)會(huì)對(duì)MSC的定義；FBM-MSCs的成骨成脂分化能力高于FL-MSCs,但是增殖能力低于FL-MSCs;多次傳代后仍保持間充質(zhì)干細(xì)胞的一些基本生物學(xué)特性。 2. FBM-MSCs及FL-MSCs具有較低的免疫原性；FBM-MSCs及FL-MSCs在體外對(duì)PBMC具有顯著的免疫抑制作用；其分泌的抑制性細(xì)胞因子IDO、TSG-6和TGF-β及細(xì)胞-細(xì)胞接觸可能在其介導(dǎo)的免疫抑制中具有重要作用。 3.三維培養(yǎng)條件下UC-MSCs的CD31、CD133和CD271表達(dá)上調(diào),體外成血管能力增強(qiáng),并且多個(gè)造血相關(guān)因子的基因表達(dá)水平上調(diào)。
【關(guān)鍵詞】：胎兒骨髓 胎肝 臍帶 間充質(zhì)干細(xì)胞 免疫抑制 三維培養(yǎng) 細(xì)胞因子
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R329.2
【目錄】：

• 摘要6-9
• ABSTRACT9-14
• 符號(hào)說(shuō)明14-16
• 前言16-18
• 第一部分 胎兒骨髓及胎肝間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定18-35
• 材料與方法18-26
• 結(jié)果26-28
• 討論28-29
• 小結(jié)29-30
• 附：圖表30-35
• 第二部分 胎兒骨髓及胎肝間充質(zhì)干細(xì)胞的體外免疫抑制作用35-49
• 材料與方法35-39
• 結(jié)果39-41
• 討論41-43
• 小結(jié)43-44
• 附：圖表44-49
• 第三部分 三維培養(yǎng)對(duì)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞表型及部分造血因子基因表達(dá)的影響49-62
• 材料與方法49-53
• 結(jié)果53-54
• 討論54-56
• 小結(jié)56
• 附：圖表56-62
• 參考文獻(xiàn)62-69
• 致謝69-71
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的文章及參與的課題71-72
• 學(xué)位論文評(píng)閱及答辯情況表72

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

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3 趙春華;;間充質(zhì)干細(xì)胞系統(tǒng):解析機(jī)體免疫調(diào)控和代謝平衡[J];中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志;2013年02期

  本文關(guān)鍵詞：間充質(zhì)干細(xì)胞的三維培養(yǎng)及其體外免疫抑制作用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：496491