本文關(guān)鍵詞：基于分子構(gòu)象設(shè)計構(gòu)建高活性細(xì)胞因子白介素IL-21，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：白介素21(IL-21)是一種可免疫調(diào)控多種細(xì)胞分化和功能的多效性細(xì)胞因子,在體液免疫和細(xì)胞免疫中均發(fā)揮重要的作用。蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)是實現(xiàn)其強(qiáng)大生物功能的基礎(chǔ),而殘基突變是提高蛋白質(zhì)活性的有效途徑之一。本論文從hIL-21突變體的建立和生物學(xué)實驗兩個方面研究hIL-21突變體,分以下兩部分： 1.hIL-21突變體的建立 通過對同源性較高的白介素進(jìn)行多序列比對、IL-21/IL-21Ra復(fù)合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行構(gòu)象分析以及軟件輔助預(yù)測來確定突變位點(diǎn),得到hIL-21的三個突變體。根據(jù)野生型(WT) hIL-21結(jié)構(gòu)采用同源模建的方法構(gòu)建了三個突變體的空間結(jié)構(gòu),與野生的IL-21相比,發(fā)現(xiàn)空間結(jié)構(gòu)沒變,說明選擇的突變位點(diǎn)以及突變后的氨基酸沒有破壞蛋白質(zhì)空間構(gòu)象；之后用FoldX來分析突變前后△G的變化,以kcal/mol為單位,結(jié)果顯示△△G(突變體1、3)0,0AAG(突變體2)0.5；隨后對IL-21的三個突變體運(yùn)用受控分子動力學(xué)(SMD)分析每個殘基的骨架順從性,發(fā)現(xiàn)IL-21的突變體3中Helix A上"stability patch'數(shù)目增加,這與高活性的IL-2的突變體D10及IL-21的突變體hIL-21/hIL-4的SMD分析結(jié)果一致,所以推測突變體3與受體結(jié)合親和力增加,活性更高,結(jié)合FoldX的分析結(jié)果,可認(rèn)為突變體3是三種突變體中最好的。 2.獲得高產(chǎn)量hIL-21突變體蛋白實驗條件的優(yōu)化 通過MODELLER同源模建方法得到hIL-21的三個突變體的結(jié)構(gòu),為了用實驗驗證hIL-21突變體的生物活性,本部分選取hIL-21突變體3重組蛋白進(jìn)行研究。首先對hIL-21突變體3重組蛋白進(jìn)行表達(dá),利用營養(yǎng)豐富的LB培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng),短時間就可以獲得高細(xì)胞密度的大腸桿菌,而且細(xì)菌細(xì)胞仍處于增長狀態(tài),之后將細(xì)胞轉(zhuǎn)入無機(jī)鹽培養(yǎng)基M9中,不斷優(yōu)化其在M9培養(yǎng)基中的培養(yǎng)條件,使菌體在優(yōu)化過的溫度下培養(yǎng)1-1.5h,再加入IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá),以獲得最高表達(dá)量的蛋白,以便在后續(xù)實驗中對目標(biāo)蛋白進(jìn)行活性研究。
【關(guān)鍵詞】：細(xì)胞因子白介素21 突變體 構(gòu)象分析 SMD 高蛋白產(chǎn)量
【學(xué)位授予單位】：華中師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R392
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-9
• 第一章 緒論9-23
• 1.1 研究背景9-12
• 1.2 蛋白質(zhì)突變相關(guān)知識介紹12-20
• 1.2.1 蛋白質(zhì)的組成12-16
• 1.2.2 影響蛋白質(zhì)活性的因素16-17
• 1.2.3 提高蛋白質(zhì)分子活性的策略17-20
• 1.3 同源模建20
• 1.4 用于YASARA的FoldX插件20-21
• 1.5 受控分子動力學(xué)模擬(SMD)模擬21
• 1.6 本課題研究思路21-23
• 第二章 IL-21突變體的建立23-35
• 2.1 引言23
• 2.2 確定突變位點(diǎn)23-26
• 2.2.1 序列比對確定突變位點(diǎn)23-24
• 2.2.2 IL-21二元復(fù)合物構(gòu)象分析確定突變位點(diǎn)24-26
• 2.2.3 輔助軟件預(yù)測突變位點(diǎn)26
• 2.3 同源模建獲得IL-21突變體結(jié)構(gòu)26
• 2.4 Foldx分析IL-21突變前后△G的變化26-27
• 2.5 進(jìn)行受控分子動力學(xué)模擬(SMD)27
• 2.5.1 結(jié)構(gòu)準(zhǔn)備27
• 2.5.2 SMD模擬實驗參數(shù)設(shè)置27
• 2.6 結(jié)果與討論27-34
• 2.6.1 確定的IL-21三個突變體中的突變位點(diǎn)27-28
• 2.6.2 WThIL-21的空間結(jié)構(gòu)以及同源模建獲得的三個突變體的空間構(gòu)象28-29
• 2.6.3 Foldx分析IL-21突變前后△G的變化29
• 2.6.4 對IL-2和D10的每個殘基進(jìn)行骨架順從性分析29-30
• 2.6.5 對IL-21及IL-21高效突變體的每個殘基進(jìn)行骨架順從性分析30-32
• 2.6.6 對設(shè)計的三個突變體的每個殘基進(jìn)行骨架順從性分析32-34
• 2.7 本章小結(jié)34-35
• 第三章 hIL-21突變體3的高產(chǎn)量蛋白獲得條件的優(yōu)化35-52
• 3.1 引言35-36
• 3.2 實驗流程圖36
• 3.3 實驗材料36-41
• 3.3.1 質(zhì)粒和菌株36
• 3.3.2 試劑和儀器36-37
• 3.3.3 主要溶液配方37-41
• 3.4 實驗部分41-46
• 3.4.1 E.coli感受態(tài)細(xì)胞Rosetta(DE3)的制備41
• 3.4.2 質(zhì)粒的處理和保存41
• 3.4.3 質(zhì)粒抽提過程41-42
• 3.4.4 轉(zhuǎn)化和預(yù)培養(yǎng)42
• 3.4.5 高細(xì)胞密度法IPTG誘導(dǎo)hIL-21突變體3重組蛋白的表達(dá)42-43
• 3.4.6 SDS-PAGE檢測43-44
• 3.4.7 在LB和M9中同時誘導(dǎo),驗證菌體和質(zhì)粒質(zhì)量是否完好44
• 3.4.8 LB中誘導(dǎo)溫度和IPTG濃度的優(yōu)化44
• 3.4.9 二次菌落選擇44-45
• 3.4.10 M9中氨基酸條件優(yōu)化45
• 3.4.11 M9培養(yǎng)基pH值優(yōu)化45
• 3.4.12 M9中誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化45-46
• 3.5 結(jié)果和討論46-50
• 3.5.1 高細(xì)胞密度法IPTG誘導(dǎo)hIL-21突變體3重組蛋白的表達(dá)46
• 3.5.2 在LB和M9中同時誘導(dǎo),驗證菌體和質(zhì)粒質(zhì)量是否完好46-47
• 3.5.3 LB中誘導(dǎo)溫度和IPTG濃度的優(yōu)化47
• 3.5.4 二次菌落選擇47-48
• 3.5.5 M9中氨基酸條件優(yōu)化48-49
• 3.5.6 M9培養(yǎng)基pH值優(yōu)化49-50
• 3.5.7 M9中誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化50
• 3.6 本章小結(jié)50-51
• 3.7 展望51-52
• 參考文獻(xiàn)52-58
• 致謝58

【共引文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 任先耀;凌文州;石家勝;劉寧;;基于自然選擇理論的動物利他行為研究[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2010年04期

2 黃秋嬋;韋友歡;韋方立;梁云貞;;物質(zhì)在被子植物體內(nèi)的運(yùn)輸機(jī)制及途徑探析[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2011年09期

3 成凡;;社會科學(xué)“包裝”法學(xué)?——它的社會科學(xué)含義[J];北大法律評論;2005年02期

4 韓慶喜;高雯芳;李寶泉;李新正;;膠州灣菲律賓蛤仔生物量與資源評估[J];動物學(xué)雜志;2004年05期

5 羅永蘭,鄒振興,向金燦,張志元;鏈霉素對油菜、水稻幼苗生長的影響[J];長沙大學(xué)學(xué)報;2005年05期

6 趙戰(zhàn)花;來向武;;媒介評論發(fā)展與社會應(yīng)激性建設(shè)[J];采寫編;2011年06期

7 李圓圓;;檔案害蟲蜚蠊防治研究[J];檔案學(xué)通訊;2012年02期

8 賀娟,汪品先;晚中新世植被變更與光合作用演化[J];地球科學(xué)進(jìn)展;2005年06期

9 張少雄;沒有必要從反應(yīng)歷程分析電子轉(zhuǎn)移[J];化學(xué)教育;2004年08期

10 劉亞潔,李江;植物分類學(xué)自學(xué)軟件的編制與應(yīng)用[J];撫州師專學(xué)報;2000年02期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 李志宏;;60年來美學(xué)基本原理的研究與科學(xué)化闡釋——認(rèn)知美學(xué)概述[A];中華美學(xué)學(xué)會第七屆全國美學(xué)大會會議論文集[C];2009年

2 趙克非;石朝鵬;程耀;蔣立本;吳進(jìn)才;;四種農(nóng)藥不同處理方式對水稻體內(nèi)可溶性糖和類黃酮含量的影響[A];公共植保與綠色防控[C];2010年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 趙珂;攀西地區(qū)藥用植物內(nèi)生及根際放線菌的多樣性與抗菌活性研究[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

2 趙宇翔;中國林業(yè)生物安全風(fēng)險評價與管理對策研究[D];北京林業(yè)大學(xué);2012年

3 宋關(guān)斌;肝癌細(xì)胞力學(xué)特性及其與細(xì)胞周期的關(guān)系研究[D];重慶大學(xué);2002年

4 施小民;細(xì)胞內(nèi)鈣振蕩和鈣波的生成、演化及其生理響應(yīng)[D];上海大學(xué);2004年

5 曹建國;刺五加生活史型特征及其形成機(jī)制的研究[D];東北林業(yè)大學(xué);2004年

6 游奎;對蝦工程化養(yǎng)殖系統(tǒng)重要元素及能量收支[D];中國科學(xué)院研究生院（海洋研究所）;2005年

7 張四海;基于社會網(wǎng)絡(luò)和博弈論的合作理論研究[D];中國科學(xué)技術(shù)大學(xué);2006年

8 王玉魁;引進(jìn)濱藜屬植物的光合途徑及抗旱生理生態(tài)特性研究[D];中國林業(yè)科學(xué)研究院;2007年

9 王利民;大豆凝集素在不同種屬動物體內(nèi)的消化動力學(xué)及抗?fàn)I養(yǎng)作用比較研究[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2007年

10 尹軻;趕超經(jīng)濟(jì)的性質(zhì)與機(jī)制研究[D];東北財經(jīng)大學(xué);2005年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 常彥莉;甘肅貝母種子發(fā)育及發(fā)芽特性研究[D];甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

2 于磊;三種殺蟲劑對寒地水稻和水稻負(fù)泥蟲的雙向效應(yīng)[D];黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué);2011年

3 趙天;基于耳石技術(shù)的唐魚自然種群死亡特征和生活史策略初步研究[D];暨南大學(xué);2011年

4 魏倩;轉(zhuǎn)35S：AtDREB1A基因地被菊花高溫脅迫耐性增強(qiáng)的機(jī)理研究[D];東北林業(yè)大學(xué);2011年

5 龔小貴;不同濃度茉莉酸甲酯對馬藍(lán)生理與蛋白質(zhì)的影響[D];福建農(nóng)林大學(xué);2011年

6 錢伶凌;人參皂甙Rg3對乳腺癌細(xì)胞系的抑制作用[D];浙江工業(yè)大學(xué);2010年

7 鄭晶;基于原子力顯微鏡研究藥物與細(xì)胞的相互作用[D];湖南大學(xué);2009年

8 宋苗苗;高溫動力學(xué)方法篩選提高蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的突變位點(diǎn)[D];華中科技大學(xué);2011年

9 曹金鳳;模型方法在高中生物教學(xué)中的應(yīng)用研究[D];華中師范大學(xué);2011年

10 許新;多媒體輔助中學(xué)生物教學(xué)的研究[D];東北師范大學(xué);2002年

  本文關(guān)鍵詞：基于分子構(gòu)象設(shè)計構(gòu)建高活性細(xì)胞因子白介素IL-21，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：496370