本文關(guān)鍵詞：DNA疫苗pSVK-CAVA宿主菌的篩選及其發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：第一章DNA疫苗pSVK-CAVA高穩(wěn)定性宿主菌的篩選與鑒定 目的：從多種不同基因型的大腸桿菌中篩選出適合本研究大分子質(zhì)粒DNA疫苗的宿主菌,并建立三級種子庫。 方法：將質(zhì)粒pSVK-CAVA (14.7kb)轉(zhuǎn)化4種大腸桿菌化學感受態(tài)細胞并提取質(zhì)粒,通過瓊脂糖凝膠電泳實驗檢測質(zhì)粒的形態(tài)結(jié)構(gòu)。對基因工程菌進行生化檢測,并通過連續(xù)傳代法和酶切鑒定進行穩(wěn)定性檢測,同時將質(zhì)粒DNA瞬時轉(zhuǎn)染至293T細胞中檢測質(zhì)粒表達能力。選取質(zhì)粒含量最高和穩(wěn)定性最好的工程菌作為原始種子分裝凍存,將原始種子庫擴大培養(yǎng),逐級建立好主種子庫和工作種子庫,即三級種子庫。 結(jié)果：確定了XL10-Gold作為質(zhì)粒DNA疫苗pSVK-CAVA的宿主菌,基因工程菌傳代穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性良好,工程菌生化特性未發(fā)生改變,質(zhì)粒能在293T細胞中體外表達,成功建立了達到中試要求的三級種子庫。 結(jié)論：大腸桿菌XL10-Gold適合作為質(zhì)粒DNA疫苗的宿主菌,解決了大質(zhì)粒在常用宿主菌中不穩(wěn)定的難題。 第二章響應面法優(yōu)化質(zhì)粒DNA疫苗工程菌發(fā)酵培養(yǎng)基 目的：篩選出基礎(chǔ)培養(yǎng)基,并利用統(tǒng)計學方法對腫瘤疫苗工程菌發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化,提高質(zhì)粒DNA產(chǎn)量,降低成本。 方法：通過搖瓶試驗,利用單因素法對幾種備選基礎(chǔ)培養(yǎng)基進行篩選,之后應用Plackett-Burman試驗設計方法和響應面法,對初始培養(yǎng)基7種組分配比進行優(yōu)化；利用Minitab軟件對實驗數(shù)據(jù)進行多元回歸分析,并建立3種主要因素與質(zhì)粒DNA產(chǎn)量之間的函數(shù)關(guān)系。將最終優(yōu)化的配方進行3次重復驗證實驗。 結(jié)果：篩選出TB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,質(zhì)粒容積產(chǎn)量達到9.9mg/L,比LB培養(yǎng)基提高了接近1倍。培養(yǎng)基3種主要因素的最佳濃度為：酵母提取物16.61g/L,甘油3.05ml/L,硫酸鎂0.185g/L,質(zhì)粒DNA產(chǎn)量能達到12.38mg/L。3次驗證實驗所測得的質(zhì)粒DNA產(chǎn)量平均能達到12.28mg/L,與預測結(jié)果基本一致。 結(jié)論：利用響應面法對腫瘤疫苗工程菌發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化可以顯著提高疫苗質(zhì)粒DNA產(chǎn)量。
【關(guān)鍵詞】：質(zhì)粒DNA 宿主菌 培養(yǎng)基 響應面法
【學位授予單位】：中南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R392;Q78
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-8
• 目錄8-10
• 縮略詞表10-11
• 1 前言11-13
• 2 DNA疫苗pSVK-CAVA高穩(wěn)定性宿主菌的篩選與鑒定13-27
• 2.1 實驗材料13-16
• 2.1.1 質(zhì)粒13
• 2.1.2 菌種13
• 2.1.3 細胞13-14
• 2.1.4 酶及主要試劑14-15
• 2.1.5 主要儀器設備15
• 2.1.6 主要溶液及配置15-16
• 2.2 實驗方法16-22
• 2.2.1 用氯化鈣制備感受態(tài)細胞16-17
• 2.2.2 轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞17
• 2.2.3 質(zhì)粒小提17
• 2.2.4 瓊脂糖凝膠電泳17-18
• 2.2.5 紫外分光光度計測OD值18
• 2.2.6 菌種培養(yǎng)條件18
• 2.2.7 宿主菌生長狀態(tài)和質(zhì)粒質(zhì)量監(jiān)測方法18
• 2.2.8 原始種子庫的建立18
• 2.2.9 主種子庫的建立18-19
• 2.2.10 工作種子庫的建立19
• 2.2.11 工作種子庫穩(wěn)定性檢測19
• 2.2.12 工程菌形態(tài)和革蘭氏染色特征檢測19-20
• 2.2.13 工程菌生化特征檢測20
• 2.2.14 質(zhì)粒pSVK-CAVA大小和酶切鑒定20
• 2.2.15 工作種子庫質(zhì)粒大量提取20-21
• 2.2.16 通過Invitrogen公司的Lipofectamine 2000試劑將大提的質(zhì)粒pSVK-CAVA轉(zhuǎn)染至293T細胞21
• 2.2.17 免疫熒光檢測質(zhì)粒pSVK-CAVA表達21-22
• 2.2.18 工程菌傳代穩(wěn)定性檢測22
• 2.3 結(jié)果22-25
• 2.3.1 宿主菌篩選22-23
• 2.3.2 三級種子庫的建立及工作種子庫的穩(wěn)定性檢測23-25
• 2.3.3 細菌形態(tài)和革蘭氏染色特征及其生化特征25
• 2.4 討論25-27
• 3 工程菌E.coli CAVA發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化27-44
• 3.1 實驗材料27-31
• 3.1.1 菌種27
• 3.1.2 主要試劑27-28
• 3.1.3 主要溶液及配置28-30
• 3.1.4 主要儀器30-31
• 3.2 實驗方法31-32
• 3.2.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的篩選31
• 3.2.2 單因素試驗確定最佳氮源和碳源31
• 3.2.3 Plackett-Burman(PB)設計篩選影響質(zhì)粒搖瓶發(fā)酵的顯著因素31-32
• 3.2.4 最陡爬坡法實驗32
• 3.2.5 響應面法確定顯著影響因素的最佳取值32
• 3.3 結(jié)果32-42
• 3.3.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的篩選32-34
• 3.3.2 不同碳源對質(zhì)粒產(chǎn)量的影響34
• 3.3.3 不同氮源對質(zhì)粒產(chǎn)量的影響34
• 3.3.4 Plackett-Burman設計篩選影響質(zhì)粒搖瓶發(fā)酵的顯著因素34-37
• 3.3.5 最陡爬坡法確定響應面因素水平的中心點37
• 3.3.6 中心復合設計(Center Composite Design；CCD)37-39
• 3.3.7 二次回歸擬合及方差分析39-40
• 3.3.8 顯著因素水平的優(yōu)化40-42
• 3.4 討論42-44
• 5 結(jié)論44-45
• 參考文獻45-47
• 綜述47-54
• 參考文獻52-54
• 攻讀學位期間主要的研究成果目錄54-55
• 致謝55

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 張亮;閻瑾琦;王越;肖毅;高昆;董金凱;王博;于繼云;;可復制型抗腫瘤DNA疫苗PSCK-2PFcGB的構(gòu)建及體內(nèi)外表達[J];南方醫(yī)科大學學報;2011年06期

2 代志凱;張翠;阮征;;試驗設計和優(yōu)化及其在發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化中的應用[J];微生物學通報;2010年06期

  本文關(guān)鍵詞：DNA疫苗pSVK-CAVA宿主菌的篩選及其發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：491400