本文關(guān)鍵詞：人CD133基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的構(gòu)建及其單克隆抗體的研制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：CD133是一種局限性分布于胞漿膜突出處的5次跨膜糖蛋白，1997年由Yin等首次報(bào)道，2000年6月由國(guó)際白細(xì)胞分化抗原工作組會(huì)議（ILDAW）正式命名為CD133。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)人CD133分子是分離和鑒定多種干細(xì)胞（尤其是腫瘤干細(xì)胞）的表面標(biāo)記分子，也有研究表明CD133+腫瘤細(xì)胞具有很強(qiáng)的增殖、自我更新和多向分化的潛能，對(duì)于CD133分子生物學(xué)特征和功能的研究有助于對(duì)腫瘤干細(xì)胞特征和功能的認(rèn)識(shí)，同時(shí)在腫瘤的診斷治療以及預(yù)后判斷方面具有重要價(jià)值，有望成為腫瘤治療的靶點(diǎn)。 雖然CD133分子從1997年發(fā)現(xiàn)以來(lái)一直被廣大科研工作者關(guān)注，但迄今為止，由于與其相作用的配體分子仍然未知，對(duì)CD133分子尚缺乏有效的研究手段，CD133的生物學(xué)功能以及其參與的信號(hào)通路至今尚需要進(jìn)一步研究闡明。目前商品化的CD133抗體（W6C3B1, AC133, AC141, Miltenyi Biotec）由于主要是識(shí)別該分子的糖基化位點(diǎn)，在運(yùn)用中有一定的局限性。鑒此，研制新型特異性抗人CD133單克隆抗體將有助于拓展對(duì)CD133分子的研究，揭示CD133的生物學(xué)功能以及該分子在腫瘤發(fā)生發(fā)展中作用機(jī)制，不僅在理論研究中具有重要意義，而且在臨床應(yīng)用中也具有重要的潛在價(jià)值。 本論文旨在通過(guò)構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)人CD133分子的L929基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，以L929/CD133和天然高表達(dá)CD133的結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116為免疫原，常規(guī)免疫BALB/c小鼠，研制鼠抗人CD133單克隆抗體，初步探討CD133分子的生物學(xué)特性，近而為研究該分子在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用奠定基礎(chǔ)。 第一部分人CD133基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的建立 【目的】構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)人CD133分子的L929/CD133基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，為研制鼠抗人CD133單克隆抗體提供免疫原和陽(yáng)性篩選細(xì)胞。 【方法】將CD133全長(zhǎng)基因雙酶切后重組入逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體pEGZ-Term。通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將測(cè)序正確的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pEGZ-Term/CD133和兩個(gè)輔助病毒載體pHIT456和pHIT60共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞293T；48h和72h后分別收集含有完整重組逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的293T細(xì)胞培養(yǎng)上清感染L929細(xì)胞；72h后，用Zeocin進(jìn)行加壓，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)CD133分子的L929/CD133基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞。 【結(jié)果】成功構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)人CD133的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株L929/CD133。 【結(jié)論】本研究成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)人CD133的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，為研制鼠抗人CD133單克隆抗體和研究CD133生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。 第二部分鼠抗人CD133單克隆抗體的研制 【目的】研制鼠抗人CD133單克隆抗體，探討該單抗的生物學(xué)特性，為進(jìn)一步研究人CD133分子的功能奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。 【方法】以穩(wěn)定表達(dá)人CD133的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株L929/CD133和天然高表達(dá)CD133的結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116為免疫原，免疫6~8周齡的BALB/c小鼠，采用B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，將免疫小鼠的脾臟細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞Ag8進(jìn)行細(xì)胞融合，并于HAT選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)；以L929/CD133作為陽(yáng)性篩選細(xì)胞株，并以轉(zhuǎn)染pEGZ-Term空載體的L929/mock細(xì)胞株作為陰性對(duì)照，采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選；對(duì)所得陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行多次克隆化培養(yǎng)，獲得1株持續(xù)穩(wěn)定分泌特異性鼠抗人CD133單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株；利用細(xì)胞核染色技術(shù)、Ig亞型快速定性試紙法、細(xì)胞免疫化學(xué)法等試驗(yàn)，對(duì)獲得的雜交瘤細(xì)胞株及單克隆抗體進(jìn)行生物學(xué)特性的鑒定；采用間接免疫熒光法檢測(cè)分析所獲單抗對(duì)不同腫瘤細(xì)胞株和腫瘤組織上CD133分子的識(shí)別。 【結(jié)果】獲得l株穩(wěn)定持續(xù)分泌鼠抗人CD133單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為18E5。經(jīng)體外連續(xù)培養(yǎng)半年以上，液氮凍存后復(fù)蘇，細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)良好，分泌抗體的性能穩(wěn)定。經(jīng)快速定性試紙分析鑒定，18E5的重鏈為IgG2b，輕鏈為κ鏈；單抗識(shí)別位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明18E5與商品化單抗AC133和AC141識(shí)別表位不同，腹水形成陽(yáng)性率為100%，腹水的收獲量平均為4ml/只。間接免疫熒光分析結(jié)果顯示：?jiǎn)慰?8E5能夠特異性識(shí)別人CD133分子，并且能夠識(shí)別人白血病細(xì)胞株U937、肺癌細(xì)胞株A549、NCI-H1299，，結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480、Caco-2、HCT116以及胰腺癌細(xì)胞株P(guān)atu-8988表面CD133分子的表達(dá)，也可識(shí)別肺癌和結(jié)腸癌標(biāo)本中CD133分子的表達(dá)。 【結(jié)論】成功獲得l株穩(wěn)定持續(xù)分泌鼠抗人CD133單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，其分泌的抗體和商品化單抗AC133和AC141識(shí)別不同的抗原表位，可以運(yùn)用于流式細(xì)胞術(shù)和免疫組化檢測(cè)分析。
【關(guān)鍵詞】：人 CD133 基因轉(zhuǎn)染 單克隆抗體
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-11
• 研究背景11-22
• 參考文獻(xiàn)17-22
• 第一部分 人 CD133 基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的建立22-31
• 參考文獻(xiàn)29-31
• 第二部分 鼠抗人 CD133 單克隆抗體的研制31-49
• 參考文獻(xiàn)47-49
• 總結(jié)與展望49-50
• 附件50-62
• 參考文獻(xiàn)60-62
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文62-63
• 本研究所獲的基金資助63-64
• 縮略詞表64-66
• 致謝66-68

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 袁曉俊;賀其圖;;Notch信號(hào)通路在白血病發(fā)生及血管新生中的作用[J];中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志;2010年02期

  本文關(guān)鍵詞：人CD133基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的構(gòu)建及其單克隆抗體的研制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：490738