本文關鍵詞：人CD133基因轉(zhuǎn)染細胞株的構(gòu)建及其單克隆抗體的研制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：CD133是一種局限性分布于胞漿膜突出處的5次跨膜糖蛋白，1997年由Yin等首次報道，2000年6月由國際白細胞分化抗原工作組會議（ILDAW）正式命名為CD133。近年來研究發(fā)現(xiàn)人CD133分子是分離和鑒定多種干細胞（尤其是腫瘤干細胞）的表面標記分子，也有研究表明CD133+腫瘤細胞具有很強的增殖、自我更新和多向分化的潛能，對于CD133分子生物學特征和功能的研究有助于對腫瘤干細胞特征和功能的認識，同時在腫瘤的診斷治療以及預后判斷方面具有重要價值，有望成為腫瘤治療的靶點。 雖然CD133分子從1997年發(fā)現(xiàn)以來一直被廣大科研工作者關注，但迄今為止，由于與其相作用的配體分子仍然未知，對CD133分子尚缺乏有效的研究手段，CD133的生物學功能以及其參與的信號通路至今尚需要進一步研究闡明。目前商品化的CD133抗體（W6C3B1, AC133, AC141, Miltenyi Biotec）由于主要是識別該分子的糖基化位點，在運用中有一定的局限性。鑒此，研制新型特異性抗人CD133單克隆抗體將有助于拓展對CD133分子的研究，揭示CD133的生物學功能以及該分子在腫瘤發(fā)生發(fā)展中作用機制，不僅在理論研究中具有重要意義，而且在臨床應用中也具有重要的潛在價值。 本論文旨在通過構(gòu)建穩(wěn)定表達人CD133分子的L929基因轉(zhuǎn)染細胞株，以L929/CD133和天然高表達CD133的結(jié)腸癌細胞株HCT116為免疫原，常規(guī)免疫BALB/c小鼠，研制鼠抗人CD133單克隆抗體，初步探討CD133分子的生物學特性，近而為研究該分子在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用奠定基礎。 第一部分人CD133基因轉(zhuǎn)染細胞株的建立 【目的】構(gòu)建穩(wěn)定表達人CD133分子的L929/CD133基因轉(zhuǎn)染細胞株，為研制鼠抗人CD133單克隆抗體提供免疫原和陽性篩選細胞。 【方法】將CD133全長基因雙酶切后重組入逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體pEGZ-Term。通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將測序正確的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pEGZ-Term/CD133和兩個輔助病毒載體pHIT456和pHIT60共轉(zhuǎn)染包裝細胞293T；48h和72h后分別收集含有完整重組逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的293T細胞培養(yǎng)上清感染L929細胞；72h后，用Zeocin進行加壓，通過流式細胞術(shù)檢測篩選獲得穩(wěn)定表達CD133分子的L929/CD133基因轉(zhuǎn)染細胞。 【結(jié)果】成功構(gòu)建穩(wěn)定表達人CD133的基因轉(zhuǎn)染細胞株L929/CD133。 【結(jié)論】本研究成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達人CD133的基因轉(zhuǎn)染細胞株，為研制鼠抗人CD133單克隆抗體和研究CD133生物學功能奠定了基礎。 第二部分鼠抗人CD133單克隆抗體的研制 【目的】研制鼠抗人CD133單克隆抗體，探討該單抗的生物學特性，為進一步研究人CD133分子的功能奠定物質(zhì)基礎。 【方法】以穩(wěn)定表達人CD133的基因轉(zhuǎn)染細胞株L929/CD133和天然高表達CD133的結(jié)腸癌細胞株HCT116為免疫原，免疫6~8周齡的BALB/c小鼠，采用B淋巴細胞雜交瘤技術(shù)，將免疫小鼠的脾臟細胞與骨髓瘤細胞Ag8進行細胞融合，并于HAT選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)；以L929/CD133作為陽性篩選細胞株，并以轉(zhuǎn)染pEGZ-Term空載體的L929/mock細胞株作為陰性對照，采用流式細胞術(shù)對雜交瘤細胞進行篩選；對所得陽性雜交瘤細胞進行多次克隆化培養(yǎng)，獲得1株持續(xù)穩(wěn)定分泌特異性鼠抗人CD133單克隆抗體的雜交瘤細胞株；利用細胞核染色技術(shù)、Ig亞型快速定性試紙法、細胞免疫化學法等試驗，對獲得的雜交瘤細胞株及單克隆抗體進行生物學特性的鑒定；采用間接免疫熒光法檢測分析所獲單抗對不同腫瘤細胞株和腫瘤組織上CD133分子的識別。 【結(jié)果】獲得l株穩(wěn)定持續(xù)分泌鼠抗人CD133單克隆抗體的雜交瘤細胞株，命名為18E5。經(jīng)體外連續(xù)培養(yǎng)半年以上，液氮凍存后復蘇，細胞的生長狀態(tài)良好，分泌抗體的性能穩(wěn)定。經(jīng)快速定性試紙分析鑒定，18E5的重鏈為IgG2b，輕鏈為κ鏈；單抗識別位點競爭實驗結(jié)果表明18E5與商品化單抗AC133和AC141識別表位不同，腹水形成陽性率為100%，腹水的收獲量平均為4ml/只。間接免疫熒光分析結(jié)果顯示：單抗18E5能夠特異性識別人CD133分子，并且能夠識別人白血病細胞株U937、肺癌細胞株A549、NCI-H1299，，結(jié)腸癌細胞株SW480、Caco-2、HCT116以及胰腺癌細胞株Patu-8988表面CD133分子的表達，也可識別肺癌和結(jié)腸癌標本中CD133分子的表達。 【結(jié)論】成功獲得l株穩(wěn)定持續(xù)分泌鼠抗人CD133單克隆抗體的雜交瘤細胞株，其分泌的抗體和商品化單抗AC133和AC141識別不同的抗原表位，可以運用于流式細胞術(shù)和免疫組化檢測分析。
【關鍵詞】：人 CD133 基因轉(zhuǎn)染 單克隆抗體
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R392
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-11
• 研究背景11-22
• 參考文獻17-22
• 第一部分 人 CD133 基因轉(zhuǎn)染細胞株的建立22-31
• 參考文獻29-31
• 第二部分 鼠抗人 CD133 單克隆抗體的研制31-49
• 參考文獻47-49
• 總結(jié)與展望49-50
• 附件50-62
• 參考文獻60-62
• 攻讀碩士學位期間發(fā)表的論文62-63
• 本研究所獲的基金資助63-64
• 縮略詞表64-66
• 致謝66-68

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 袁曉俊;賀其圖;;Notch信號通路在白血病發(fā)生及血管新生中的作用[J];中國實驗血液學雜志;2010年02期

  本文關鍵詞：人CD133基因轉(zhuǎn)染細胞株的構(gòu)建及其單克隆抗體的研制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：490738