本文關(guān)鍵詞：自噬及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在內(nèi)皮細(xì)胞管型形成中的作用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：利用新生血管恢復(fù)缺血組織血液供應(yīng)以減少心肌損傷,恢復(fù)心功能,是治療缺血性心臟病的重要措施之一。大量研究表明,自噬和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激具有心肌保護(hù)和促細(xì)胞分化作用。同時,有報道表明白噬參與缺氧誘導(dǎo)的血管新生過程。然而重要的血管生成誘導(dǎo)因子血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)介導(dǎo)的血管新生是否與自噬和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)并不清楚。本研究旨在探討自噬及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在VEGF介導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cell, HUVEC)管型形成中的作用。為以內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬為靶點的血管生成調(diào)控藥物的研發(fā)奠定相關(guān)理論和實驗基礎(chǔ)。 方法：以不同濃度和時間VEGF處理培養(yǎng)的HUVEC為模型,采用二氫羅丹明(Dihydrorhodamine123, DHR123)染色分析活性氧(reactive oxygen species, ROS)產(chǎn)生,采用免疫印跡、RT-PCR技術(shù)檢測自噬及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物蛋白水平及mRNA水平表達(dá),采用Matrigel分析內(nèi)皮細(xì)胞管型形成能力以及細(xì)胞劃痕實驗分析細(xì)胞遷移能力。同時采用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制物、自噬抑制物以及白噬相關(guān)標(biāo)志物基因沉默技術(shù)觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬程度下調(diào)后對管型形成的影響。以小鼠左冠狀動脈前降支結(jié)扎為心肌缺血模型,采用Western blot檢測血管生成及自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平,免疫組織化學(xué)分析血管生成標(biāo)志物的表達(dá)情況。 結(jié)果：DHR123染色定量分析顯示VEGF促進(jìn)HUVEC中ROS產(chǎn)生,且呈現(xiàn)一定的濃度和時間依賴性關(guān)系。同時,RT-PCR和免疫印跡分析顯示：VEGF促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因肌糖需求酶-1(Inositol requiring enzyme1, IRE-1),葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein, GRP78/Bip),自噬相關(guān)基因4(autophagy-related gene4, ATG4),自噬相關(guān)基因5(autophagy-related gene5, ATG5), Beclin-1(autophagy-related gene6, ATG6/Beclin-1) mRNA及蛋白表達(dá),并在一定程度上呈現(xiàn)濃度及時間依賴性。利用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)及Beclin-1特異性siRNA阻斷白噬發(fā)生后能顯著抑制(?)100ng/ml VEGF介導(dǎo)的HUVEC管型形成,降低細(xì)胞遷移能力。而且阻斷自噬發(fā)生,并不影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生,其相應(yīng)的標(biāo)志物(IRE-1,Bip)仍處于高表達(dá)狀態(tài)。利用�；切苋パ跄懰徕c(Tauroursodeoxycholic acid sodium salt, TUDC)阻斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,也同樣可以抑制(?)VEGF介導(dǎo)的HUVEC形成管型的能力和細(xì)胞遷移能力,同時也抑制了自噬發(fā)生,其相應(yīng)標(biāo)志物L(fēng)C3-Ⅱ及Beclin-1的表達(dá)下降。整體動物實驗結(jié)果顯示,心肌缺血15天后小鼠心臟組織血管生成標(biāo)志物血管內(nèi)皮鈣粘蛋白(vascular endothelial-cadherin, VE-cadherin)表達(dá)增多,同時自噬相關(guān)蛋白LC3表達(dá)也增多。 結(jié)論：1.整體動物水平顯示,缺血后血管生成與LC3-Π表達(dá)呈同向變化。2.細(xì)胞水平顯示VEGF通過誘導(dǎo)ROS生成,引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬,進(jìn)而促進(jìn)HUVEC管型形成。
【關(guān)鍵詞】：血管內(nèi)皮生長因子 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 自噬 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 管型形成
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R363
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 目錄9-11
• 符號說明11-12
• 1 前言12-15
• 2 材料與方法15-22
• 2.1 材料15-17
• 2.1.1. 細(xì)胞15
• 2.1.2 實驗動物15
• 2.1.3 主要試劑及抗體15
• 2.1.4 主要儀器設(shè)備15-16
• 2.1.5 引物序列16-17
• 2.2 方法17-22
• 2.2.1 臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)17
• 2.2.2 細(xì)胞總RNA提取17
• 2.2.3 RT-PCR17-18
• 2.2.4 細(xì)胞總蛋白樣品的制備18
• 2.2.5 免疫印記分析(Western blot)18
• 2.2.6 脂質(zhì)體介導(dǎo)的瞬時轉(zhuǎn)染18
• 2.2.7 劃痕實驗18-19
• 2.2.8 Matrigel實驗19
• 2.2.9 ROS定量分析19
• 2.2.10 實驗動物飼養(yǎng)與分組19-20
• 2.2.11 小鼠心肌缺血模型制備20
• 2.2.12 心肌組織蛋白提取20
• 2.2.13 切片制備及免疫組織化學(xué)20-21
• 2.2.14 統(tǒng)計分析21-22
• 3 實驗結(jié)果22-39
• 3.1 VEGF誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞自噬22-25
• 3.1.1 Western blot檢測不同時間VEGF誘導(dǎo)的自噬標(biāo)志蛋白表達(dá)22-23
• 3.1.2 Western blot檢測不同濃度VEGF誘導(dǎo)的自噬標(biāo)志蛋白表達(dá)23-24
• 3.1.3 RT-PCR檢測不同時間VEGF誘導(dǎo)的自噬相關(guān)基因mRNA表達(dá)24
• 3.1.4 RT-PCR檢測不同濃度VEGF誘導(dǎo)的自噬相關(guān)基因mRNA表達(dá)情況24-25
• 3.2 VEGF誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞活性氧生成25-27
• 3.2.1 不同時間VEGF誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生25-26
• 3.2.2 不同濃度VEGF誘導(dǎo)的活性氧ROS產(chǎn)生26-27
• 3.3 VEGF激發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激27-30
• 3.3.1 Western blot檢測不同濃度VEGF誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白表達(dá)27-28
• 3.3.2 Western blot檢測不同時間VEGF誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白表達(dá)28-29
• 3.3.3 RT-PCR檢測不同濃度VEGF誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因mRNA表達(dá)29
• 3.3.4 RT-PCR檢測不同時間VEGF誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因mRNA表達(dá)29-30
• 3.4 自噬阻斷對HUVEC管型形成能力的影響30-33
• 3.4.1 Western blot檢測自噬阻斷對VEGF誘導(dǎo)的自噬及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響30-31
• 3.4.2 劃痕實驗檢測抑制自噬對VEGF誘導(dǎo)的HUVEC遷移的影響31-32
• 3.4.3 基質(zhì)膠實驗檢測抑制自噬對VEGF誘導(dǎo)的HUVEC管型形成的影響32-33
• 3.5 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在VEGF誘導(dǎo)的管型形成中的作用33-36
• 3.5.1 Western blot檢測抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對VEGF誘導(dǎo)的自噬及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響33-34
• 3.5.2 劃痕實驗檢測抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對VEGF誘導(dǎo)的HUVEC遷移力的影響34-35
• 3.5.3 基質(zhì)膠實驗檢測抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對VEGF誘導(dǎo)的HUVEC管型形成能力的影響35-36
• 3.6 小鼠心肌缺血對血管生成與自噬的影響36-39
• 3.6.1 Western blot檢測小鼠心肌缺血對血管生成及自噬的影響36-37
• 3.6.2 免疫組織化學(xué)檢測小鼠心肌缺血對血管形成的影響37-39
• 4 討論39-41
• 5 結(jié)論41-42
• 參考文獻(xiàn)42-45
• 綜述45-56
• 參考文獻(xiàn)52-56
• 攻讀學(xué)位期間主要研究成果56-57
• 致謝57

【共引文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：自噬及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在內(nèi)皮細(xì)胞管型形成中的作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：490694