發(fā)布時(shí)間：2017-06-26 19:18

  本文關(guān)鍵詞：重組人抗PAI抑制作用的新型纖溶酶原激活劑突變體的表達(dá)與活性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：血栓性急性心腦血管病是嚴(yán)重威脅人類健康的疾病。目前在治療這類疾病方面已經(jīng)取得了重大進(jìn)展,溶栓治療是其中最為重要的技術(shù)之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì),全世界每年死于該類疾病的患者大約有1600萬人,我國(guó)每年患有這類疾病的人數(shù)也有500萬人。因此,研發(fā)出新的高效的溶栓藥物受到越來越多研究機(jī)構(gòu)的重視。 組織型纖溶酶原激活劑(tissue plasminogen activator,t-PA)是纖溶系統(tǒng)的生理性激活劑,由于t-PA與血栓基質(zhì)纖維蛋白有很強(qiáng)的特異性親和力,能有效地在血栓局部激活纖溶酶原為纖溶酶而使血栓溶解。重組t-PA是利用基因工程技術(shù)開發(fā)出的用于治療心腦血管病的特效藥,與鏈激酶、尿激酶等溶栓劑比較具有作用快、不造成全身的纖維蛋白溶解、療效高等優(yōu)點(diǎn),但是在臨床應(yīng)用中也有很多不足,如在體內(nèi)可被肝細(xì)胞迅速清除,在血漿中存在纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAI-1)可快速抑制其活性。t-PA在血中的半衰期很短(1～5min)使臨床溶栓治療時(shí)為維持有效濃度需大劑量(100～150mg),增加了系統(tǒng)性纖溶引起出血的危險(xiǎn)。由德國(guó)的勃林格殷格翰(Boehringer Ingelheim)制藥公司生產(chǎn)的瑞替普酶(rt-PA)和阿替普酶(CHO-t-PA),已經(jīng)成功投放市場(chǎng)用于治療血栓性疾病。首先它們?cè)隗w內(nèi)的半衰期延長(zhǎng)到了18min,且增強(qiáng)了與纖維蛋白的結(jié)合力,并且還是可逆結(jié)合,大大提高了激活纖溶酶原的活性。其次可通過靜脈給藥,且降低了用藥劑量。但是它們的分子結(jié)構(gòu)中有PAI-1的結(jié)合位點(diǎn),血液中的PAI-1與其結(jié)合從而抑制纖溶活性。有國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道血栓性疾病患者血中PAI-1濃度高于正常人,體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了5U·mL-1的PAI-1可以使5ng·mL-1rt-PA和天然CHO-t-PA失活,所以臨床用量仍較高。 因此研制半衰期長(zhǎng)且活性不受PAI-1抑制、用量小、成本低、副作用小的t-PA突變體成為當(dāng)務(wù)之急,本實(shí)驗(yàn)室在重組t-PA的基礎(chǔ)上使PAI-1位點(diǎn)的堿基突變,去除了指狀區(qū)、表皮生長(zhǎng)因子區(qū)和Kringle1區(qū),使含有373-384PAI-1結(jié)合位點(diǎn)的rt-PA的基因序列AAG CAC AGGAGG突變?yōu)镚CG GCC GCG GCG,氨基酸KHRR相應(yīng)變?yōu)锳AAA,構(gòu)建了新的t-PA突變體,并克隆于大腸桿菌表達(dá)載體。本研究構(gòu)建pBV220-t-PA重組表達(dá)質(zhì)粒,經(jīng)DNA測(cè)序確認(rèn)后,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α,溫控誘導(dǎo)表達(dá),凝膠過濾法對(duì)包涵體蛋白進(jìn)行初步純化,復(fù)性后,過刺桐胰蛋白酶親和層析柱純化,酶動(dòng)力學(xué)分析其活性。測(cè)序證實(shí)t-PA突變體的DNA序列正確,表達(dá)蛋白占總菌體蛋白30%,比活性為4.2×105IU·mg-1, t-PA突變體與PAI-1反應(yīng)后其活性未受到抑制。t-PA突變體酶的米氏常數(shù)Km為0.3298μmol·L-1,最大水解速度Vmax為0.0476μmol·min-1·g-1。經(jīng)生物學(xué)活性測(cè)定,表達(dá)蛋白能夠明顯抵抗PAI的抑制作用,并具有良好的生物活性,該突變體有可能成為用量更少、療效更佳的新型溶栓藥物。
【關(guān)鍵詞】：t-PA突變體 PAI-1 基因克隆 蛋白表達(dá) 動(dòng)力學(xué)常數(shù)
【學(xué)位授予單位】：河北北方學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R3416
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-9
• 英文縮寫9-11
• 前言11-12
• 材料與方法12-27
• 結(jié)果27-30
• 附圖30-37
• 討論37-40
• 結(jié)論40-41
• 參考文獻(xiàn)41-45
• 綜述45-57
• 參考文獻(xiàn)52-57
• 致謝57-59
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷59-60

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前8條

1 李瑩;陳斌;何正波;;溶栓劑的研發(fā)現(xiàn)狀及展望[J];重慶師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2010年01期

2 文浩平;和七一;鄧疆渝;李金波;余曉東;;微生物源纖溶酶的研究進(jìn)展[J];重慶師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2011年03期

3 張丹丹;王維亭;趙專友;;蛇毒類抗血栓蛋白酶的研究進(jìn)展[J];現(xiàn)代藥物與臨床;2012年04期

4 江成英;郭宏文;Q，

本文編號(hào)：487339