本文關(guān)鍵詞：蓖麻毒素單克隆抗體的制備，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：蓖麻毒素（Ricin）是一種核糖體失活蛋白，由A、B兩個(gè)肽鏈以二硫鍵共價(jià)相連接，其A鏈在B鏈的協(xié)助下，容易穿透細(xì)胞膜，通過(guò)切斷一個(gè)N-糖苷鍵破壞核蛋白體60S亞單位，抑制蛋白質(zhì)合成，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。目前，A鏈和B鏈的氨基酸序列以及二級(jí)結(jié)構(gòu)已基本清楚。毒素B鏈上含有兩個(gè)半乳糖或半乳糖殘基結(jié)合位點(diǎn)，可和細(xì)胞表面的含半乳糖殘基結(jié)合，通過(guò)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，發(fā)揮毒性作用。蓖麻毒素A、B鏈上還分別含有1和2個(gè)糖支鏈，鏈末端均為甘露糖殘基，而網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞、特別是巨噬細(xì)胞表面富含甘露糖受體，可優(yōu)先攝取蓖麻毒素，這對(duì)于毒素的生物功能具有重要意義。 蓖麻毒素來(lái)源廣泛，較容易提取，而且性質(zhì)穩(wěn)定。蓖麻毒素的毒性作用機(jī)理研究，豐富了人們對(duì)蓖麻毒素毒性作用的認(rèn)識(shí)，由于蓖麻毒素毒性強(qiáng)，目前還沒(méi)有特效解毒藥及預(yù)防疫苗。近十年來(lái)，國(guó)內(nèi)外軍事醫(yī)學(xué)專家越來(lái)越擔(dān)心恐怖組織運(yùn)用蓖麻毒素進(jìn)行恐怖襲擊。美國(guó)疾病控制中心把蓖麻毒素列為 B‖武器——具有中度威脅。在《禁止化學(xué)武器公約》中，被列為最為嚴(yán)格的控制對(duì)象之一。 蓖麻毒素的偵檢，是軍事醫(yī)學(xué)及反恐斗爭(zhēng)研究的重要內(nèi)容�；谔禺愋钥贵w建立的免疫分析方法，具有特異、靈敏和快速等特點(diǎn)。制備蓖麻毒素特異性單克隆抗體是建立該毒素檢測(cè)分析方法的基礎(chǔ)。同時(shí)，高親和力的抗毒抗體可以用于蓖麻毒素中毒被動(dòng)免疫治療。因此，為建立靈敏、快速檢測(cè)蓖麻毒素的方法，篩選可能有效的抗毒抗體，我們以原核表達(dá)的蓖麻毒素A、B鏈為免疫抗原，制備了抗蓖麻毒素的單克隆抗體，用于蓖麻毒素檢測(cè)分析及抗毒治療研究。 Ricin幾乎對(duì)所有真核細(xì)胞具有很強(qiáng)的毒害作用�？紤]到Ricin是通過(guò)RTB（蓖麻毒素B鏈蛋白）的糖基受體介導(dǎo)毒素的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，發(fā)揮RTA(蓖麻毒素A鏈蛋白)的蛋白合成抑制活性，且全毒素免疫毒性較大等原因，我們構(gòu)建pET28a-RTA、pET28a-RTB原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，誘導(dǎo)RTA、RTB融合蛋白的可溶性表達(dá)，超聲裂解表達(dá)后菌體，利用融合蛋白上的組氨酸標(biāo)簽進(jìn)行親和層析純化目的蛋白，免疫小鼠制備單克隆抗體。 實(shí)驗(yàn)方法：構(gòu)建原核表達(dá)載體，用于RTA、RTB在E.coli(大腸桿菌)中表達(dá)。純化重組A、B鏈蛋白。以重組蛋白免疫小鼠，以重組蛋白進(jìn)行初篩，以天然毒素蛋白進(jìn)行確證分泌抗體的細(xì)胞株。ELISA方法分析抗體的抗原表位，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)行抗毒活性初步探討，建立糖基蛋白-Ricin-單克隆抗體-HRP標(biāo)記羊抗鼠抗體的夾心ELISA方法。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：構(gòu)建了pET28a-RTA和pET28a-RTB系列重組質(zhì)粒載體，將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)后表達(dá)了可溶性的融合蛋白。通過(guò)鎳柱親和純化RTB，蛋白純度在90%以上，可以用于作為抗原去免疫動(dòng)物，制備抗體。以重組RTB為抗原免疫小鼠獲得了8株能夠識(shí)別天然蓖麻毒素的單克隆抗體，分別是38-3-8，14-1，3-2-7，2-28-5-6，8-1-1-8，13-2-4，7-8-24，9-2。制備小鼠腹水，并利用親和層析純化了單克隆抗體。ELISA和Western blot檢測(cè)抗體能與RTB和Ricin特異性結(jié)合。用于ELISA分析抗體配對(duì)，，8株抗體均能夠識(shí)別重組B鏈毒素和天然毒素；8株抗體之間不能夠配對(duì)；8株抗體和抗RTA抗體也不能配對(duì)。同樣方法制備了4株抗RTA單克隆抗體：1-1,13-4,4-2-15-4,2-07。4株抗體均能和Ricin特異性結(jié)合，2株抗體(1-1,4-2-15-4)與RTB有較弱的結(jié)合，2株抗RTA抗體(13-4，2-07)與RTA結(jié)合特異性強(qiáng)，抗體13-4，2-07可以用于建立糖基蛋白-Ricin-單克隆抗體-HRP標(biāo)記羊抗鼠抗體的夾心ELISA方法。 由以上結(jié)果得出如下結(jié)論：成功制備了RTA和RTB重組蛋白，以重組蛋白為抗原制備了單克隆抗體，得到了8株抗RTB、4株抗RTA抗體，ELISA和Western blot測(cè)定了它們的抗原特異性。其中抗體13-4,2-07可用于建立的糖基蛋白-Ricin-單克隆抗體-HRP標(biāo)記羊抗鼠抗體的夾心ELISA方法，用于Ricin的特異性檢測(cè)。 蓖麻毒素的B鏈?zhǔn)菐椭鶤鏈進(jìn)入細(xì)胞膜的，本身沒(méi)有毒性，可以用已經(jīng)獲得針對(duì)B鏈的抗體，對(duì)蓖麻毒素的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和作用機(jī)理進(jìn)行研究。將所有針對(duì)A鏈和B鏈的抗體進(jìn)行配對(duì)分析，并在分析的結(jié)果之上，進(jìn)行ELISA驗(yàn)證，希望能找到配對(duì)的抗體，組裝成試劑盒，用于蓖麻毒素的定性和定量檢測(cè)。最后還將對(duì)獲得的針對(duì)A鏈的抗體進(jìn)行功能研究，看是否有抗體具有中和活性，將具有中和活性的抗體人源化，將來(lái)或可以用于蓖麻毒素中毒的急性期的救治。
【關(guān)鍵詞】：蓖麻毒素 單克隆抗體 酶聯(lián)免疫分析
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R392
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• ABSTRACT6-9
• 英文縮寫(xiě)表9-13
• 1 引言13-20
• 1.1 蓖麻毒素的結(jié)構(gòu)、毒性作用機(jī)理13-14
• 1.2 蓖麻毒素生物恐怖及其醫(yī)學(xué)防護(hù)救治14-16
• 1.3 蓖麻毒素抗體最有可能成為蓖麻毒素中毒急救特效藥16-17
• 1.4 蓖麻毒素國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展及展望17-20
• 2 蓖麻毒素 B 鏈蛋白的制備20-35
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料20-23
• 2.1.1 菌株、質(zhì)粒及其它生化試劑20
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器20-21
• 2.1.3 溶液與培養(yǎng)基21-23
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法23-27
• 2.2.1 蛋白的制備23-25
• 2.2.2 重組質(zhì)粒驗(yàn)證25
• 2.2.3 蛋白質(zhì)純化25-26
• 2.2.4 肽質(zhì)量指紋譜測(cè)定26
• 2.2.5 Bradford 法測(cè)定表達(dá)蛋白的濃度26-27
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果27-32
• 2.3.1 質(zhì)�；蝌�(yàn)證結(jié)果27
• 2.3.2 抗原(IPTG 誘導(dǎo))表達(dá)27-28
• 2.3.3 蓖麻毒素 B 鏈蛋白的純化28-29
• 2.3.4 肽質(zhì)量指紋譜測(cè)定29-31
• 2.3.5 Bradford 法對(duì)濃度的測(cè)定31-32
• 2.4 討論32-35
• 3 蓖麻毒素 B 鏈抗體的制備35-63
• 3.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)備及材料35-40
• 3.1.1 主要儀器設(shè)備35-36
• 3.1.2 實(shí)驗(yàn)材料36-40
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法40-53
• 3.2.1 動(dòng)物免疫40-42
• 3.2.2 小鼠實(shí)體瘤制備42
• 3.2.3 細(xì)胞融合42-44
• 3.2.4 細(xì)胞篩選44-45
• 3.2.5 細(xì)胞克隆化45-47
• 3.2.6 陽(yáng)性細(xì)胞株凍存與復(fù)蘇47
• 3.2.7 大量制備抗體47-49
• 3.2.8 IgG SDS-PAGE49-51
• 3.2.9 抗體定性檢測(cè)51-53
• 3.3 配對(duì)研究53
• 3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果53-60
• 3.5 討論60-63
• 4 蓖麻毒素 A 鏈抗體的制備63-76
• 4.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)備及材料63-68
• 4.1.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備63-64
• 4.1.2 實(shí)驗(yàn)材料64-68
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法68-72
• 4.2.1 動(dòng)物免疫68-70
• 4.2.2 小鼠實(shí)體瘤制備70
• 4.2.3 細(xì)胞融合70-71
• 4.2.4 細(xì)胞篩選71
• 4.2.5 抗體純化及效價(jià)的測(cè)定71-72
• 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果72-73
• 4.4 討論73-76
• 5 單克隆抗體抗原特異性及應(yīng)用76-87
• 5.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)備及材料76-80
• 5.1.1 主要儀器設(shè)備76-77
• 5.1.2 實(shí)驗(yàn)材料77-80
• 5.2 實(shí)驗(yàn)方法80-81
• 5.2.1 ELISA 測(cè)定80
• 5.2.2 糖蛋白 ASF-Ricin-單抗-HRP 標(biāo)記羊抗鼠方法檢測(cè) Ricin80-81
• 5.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果81-85
• 5.3.1 單克隆抗體的抗原特異性分析81-85
• 5.4 討論85-87
• 6 結(jié)論87-88
• 參考文獻(xiàn)88-93
• 作者簡(jiǎn)介及在學(xué)期間取得的科研成果93-94
• 致謝94

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：485305