本文關鍵詞：斑馬魚模型用于沙門菌質粒毒力基因spv對感染及自噬影響的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的： 幼年斑馬魚通體透明，用熒光菌感染后可在熒光顯微鏡下動態(tài)追蹤細菌的分布與播散，是研究病原菌與宿主相互作用的理想模式生物。為研究鼠傷寒沙門菌（Salmonella enterica serovar typhimurium，S.typhimurium，STM）感染后對斑馬魚自噬的影響，本研究第一部分構建沙門菌-斑馬魚感染模型。為研究沙門菌質粒毒力基因（Salmonella plasmid virulence genes，spv）增強宿主菌毒力的分子機制，第二部分以攜帶spv基因的鼠傷寒沙門菌野生株STM-WT和spv基因缺失突變株STM-Δspv感染斑馬魚，探討該基因對斑馬魚體內感染及自噬的影響，為進一步闡明沙門菌質粒毒力基因的致病機制、防治沙門菌感染及新藥靶位的發(fā)現提供理論和實驗依據。 方法： 1.沙門菌-斑馬魚感染模型的構建及用于自噬的研究 (1)沙門菌-斑馬魚感染模型適宜菌量的確定 不同濃度鼠傷寒沙門菌UF110浸染受精后72h（hours post-fertilization，hpf）的幼年斑馬魚，統(tǒng)計斑馬魚7d內的死亡數目并繪制存活率曲線以確定適宜的細菌感染量。 (2)沙門菌在斑馬魚體內的播散繁殖 以綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）標記的鼠傷寒沙門菌UF110感染72hpf幼年斑馬魚，熒光顯微鏡下觀察細菌在體內的播散。分別收集感染后6、8、10、12、14、16和24h的斑馬魚進行阿米卡星（Amikacin，AMK）殺菌實驗。計數整條魚感染的細菌量和侵入斑馬魚細胞內的細菌量，檢測細菌在體內的繁殖情況。 (3)鼠傷寒沙門菌對斑馬魚感染模型自噬的影響 收集感染后6、8、10、12和14h的斑馬魚，蛋白免疫印跡（western-blotting，WB）檢測自噬標志蛋白—微管相關蛋白1輕鏈3-Ⅱ（microtubule-associated protein1light chain3-Ⅱ，Lc3-Ⅱ）及自噬底物蛋白p62的表達；透射電鏡（transmissionelectron microscope，TEM）觀察斑馬魚小腸上皮細胞的超微結構。 (4) Torin1及氯喹（chloroquine，CQ）對沙門菌-斑馬魚感染模型自噬的影響 為探討自噬激動劑Torin1和溶酶體抑制劑CQ對斑馬魚感染模型的作用，，本研究首先測定藥物對細菌生長曲線及斑馬魚存活率的影響，并用WB檢測自噬相關蛋白的表達以確定Torin1及CQ的適宜工作濃度。分別以適宜濃度的Torin1和CQ單獨及共同預處理斑馬魚后與受試菌共培養(yǎng)，收集感染后的斑馬魚進行細菌計數，WB檢測Lc3-Ⅱ和p62的表達。 2.斑馬魚模型用于沙門菌質粒毒力基因spv對感染及自噬影響的研究 (1)紅色熒光菌的構建 在綠色激發(fā)光下斑馬魚卵黃囊背景較強難以辨認，為降低背景光的干擾，首先構建背景干擾較小的紅色熒光菌。將表達紅色熒光蛋白（red fluorescent protein，RFP）的質粒pGMDs3用CaCl2轉化法分別導入攜帶spv基因的野生株STM-WT和spv基因缺失突變株STM-Δspv，熒光顯微鏡鑒定后，活體成像儀觀察細菌發(fā)光情況，確定熒光強度與細菌數量的關系，并檢測RFP對細菌生長曲線的影響。 (2)沙門菌質粒毒力基因spv對斑馬魚半數致死量LD50的影響 用不同濃度STM-WT和STM-Δspv感染斑馬魚后，統(tǒng)計斑馬魚7d內的死亡數目，用Reed-Muench法計算受試菌對斑馬魚的LD50。 (3)沙門菌質粒毒力基因spv對細菌在斑馬魚體內繁殖播散的影響 將STM-WT和STM-Δspv分別感染斑馬魚不同時間后，熒光顯微鏡下比較受試菌在體內的播散。收集感染后4、8、12、16和24h的斑馬魚進行AMK殺菌實驗，比較兩株菌感染整條魚的細菌量及侵入斑馬魚細胞內菌量的差異。 (4)沙門菌質粒毒力基因spv對斑馬魚感染模型自噬的影響 將STM-WT和STM-Δspv分別感染斑馬魚不同時間后，WB檢測自噬標志蛋白Lc3-Ⅱ和自噬底物蛋白p62的表達；Torin1和CQ單獨預處理斑馬魚24h后，分別與兩株受試菌共作用8h，WB檢測干預后Lc3-Ⅱ和p62的表達并計數藥物干預后細胞內活菌數。 結果： 1.沙門菌-斑馬魚感染模型的構建及對自噬的研究 (1)沙門菌-斑馬魚感染模型適宜菌量的確定：109cfu/ml細菌量感染斑馬魚后，兩天內對其無顯著影響，感染后3d出現尾巴卷曲、游動時協(xié)調性和靈活能力下降的情況,并出現死亡現象。依據研究目的，自噬是發(fā)生在感染早期的事件，選擇感染后兩天內對斑馬魚存活無顯著影響的109cfu/ml為后續(xù)實驗用菌量。 (2)沙門菌在斑馬魚體內的播散繁殖：熒光顯微鏡下發(fā)現，感染后4h（hourspost infection，hpi）斑馬魚口周及卵黃囊中均有細菌侵入，8hpi斑馬魚腸道中可檢測到細菌信號。此后細菌逐漸播散，1d后眼睛周圍及頭部出現綠色熒光信號，2d后播散至斑馬魚整個頭部，3d后遍布全身。細菌計數結果顯示，未加AMK組整條魚感染的細菌量隨時間進行而增加，10hpi感染的細菌量顯著高于8hpi感染菌量(p0.001)；加入AMK殺死胞外菌后，細菌量明顯降低，且10hpi魚體中侵入細胞內的細菌量顯著低于8hpi胞內菌量(p0.001)。 (3)鼠傷寒沙門菌對斑馬魚感染模型自噬的影響：WB結果顯示，細菌感染斑馬魚8h后，自噬標志蛋白Lc3-Ⅱ的表達顯著高于對照組及其余時間點(p0.001)，自噬底物蛋白p62的表達則顯著降低(p0.01)；10hpi上述趨勢仍存在(p0.05)。TEM結果顯示，8hpi幼魚腸道可觀察到腫脹的線粒體結構，同時還見包裹著細菌的雙層膜自噬體結構和降解內容物的單層膜溶酶體結構。 (4) Torin1和CQ對沙門菌-斑馬魚感染模型自噬的影響：0.4μmol/L Torin1作用斑馬魚24h后，斑馬魚存活率為100%，Lc3-Ⅱ表達水平最高(p0.001)；50μmol/LCQ作用斑馬魚24h后，斑馬魚未出現死亡，且p62表達水平顯著增高(p0.01)。細菌計數結果顯示，Torin1處理組細菌數目顯著降低(p0.01)，而CQ處理組(p0.05)和兩種藥物共處理組(p0.001)細菌數目均增加。WB結果表明，與正常感染組相比，Torin1處理組Lc3-Ⅱ表達水平顯著升高(p0.01)，p62表達水平顯著降低(p0.01)；CQ處理組(p0.01)與兩種藥物共處理組(p0.001)，Lc3-Ⅱ與p62表達水平均顯著增加。 2.斑馬魚感染模型用于沙門菌質粒毒力基因spv對感染及自噬影響的研究 (1)紅色熒光菌的構建：在熒光顯微鏡下可觀察到紅色桿狀細菌，其熒光強度與細菌數量呈線性正相關；紅色熒光蛋白RFP對細菌24h內生長曲線未見顯著影響。 (2)沙門菌質粒毒力基因spv對斑馬魚半數致死量LD50的影響：野生株STM-WT的LD50為1.17×107cfu/ml，突變株STM-Δspv的LD50為1.95×108cfu/ml，說明spv能顯著降低宿主菌對斑馬魚的LD50。 (3)沙門菌質粒毒力基因spv對細菌在斑馬魚體內繁殖播散的影響 熒光顯微鏡檢測結果顯示，感染后4~6h，野生株STM-WT和突變株STM-Δspv感染組斑馬魚口周均可檢測到發(fā)光菌；8h后兩組斑馬魚腸道中均可檢測到紅色熒光菌，且STM-WT感染組熒光強度高于STM-Δspv感染組。隨著感染時間的延長，STM-WT在斑馬魚體內的繁殖和擴散速度較快，2d已播散至全身；而STM-Δspv繁殖和擴散程度較慢，直至3d播散至全身。細菌計數結果顯示，STM-WT感染組整條魚感染的細菌量在同一感染時間點顯著高于STM-Δspv感染組（p0.05，p0.01）；加入AMK殺死胞外菌后，細菌量明顯降低，但STM-WT感染組侵入魚體細胞內的細菌量仍顯著高于STM-Δspv感染組（p0.01，p0.001）。 (4)沙門菌質粒毒力基因spv對斑馬魚感染模型自噬的影響 WB檢測自噬標志蛋白Lc3-Ⅱ和自噬底物蛋白p62結果顯示，細菌感染斑馬魚8h后，野生株STM-WT感染組Lc3-Ⅱ表達水平顯著低于spv基因缺失突變株STM-Δspv感染組（p0.01），而p62表達水平顯著升高（p0.01）。10h依然保持上述趨勢（Lc3-Ⅱ，p0.01；p62，p0.05），但6h未見明顯差異（p0.05）。Torin1干預后，STM-WT感染組Lc3-Ⅱ水平提高（p0.05），但與STM-Δspv感染組間無顯著差異（p0.05）；CQ干預后，各組Lc3-Ⅱ水平均有所提高（p0.01），且STM-WT感染組仍低于STM-Δspv感染組（p0.01）；各組p62水平也顯著增高（p0.01），但各感染組間無顯著差異（p0.05）。細菌計數結果顯示，感染8h后，STM-WT感染組胞內CFU顯著高于STM-Δspv感染組（p0.01）；Torin1干預后，兩組胞內CFU均有減少，且兩組間差異減�。╬0.05）；CQ干預后，兩組胞內CFU無顯著差異（p0.05）。 結論： 1.成功構建了可用于研究自噬的沙門菌-斑馬魚感染模型。 2.自噬具有保守性，Torin1和CQ對斑馬魚自噬的影響與對哺乳動物細胞自噬的影響相似。 3.沙門菌質粒毒力基因spv可增強鼠傷寒沙門菌對斑馬魚的毒力，促進宿主菌在體內的繁殖和播散，從而加重感染。spv對鼠傷寒沙門菌所致的斑馬魚異源自噬具有抑制作用，CQ干預結果顯示，其作用時相早于溶酶體降解過程，在早期自噬體形成階段。
【關鍵詞】：斑馬魚 鼠傷寒沙門菌 spv 自噬
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R378.22
【目錄】：

• 中文提要4-9
• Abstract9-16
• 引言16-20
• 第一部分 沙門菌-斑馬魚感染模型的構建及用于自噬的研究20-37
• 1. 材料與方法20-26
• 1.1 材料20-23
• 1.2 方法23-26
• 1.3 統(tǒng)計學處理26
• 2. 結果26-34
• 2.1 溫度與 GFP 對細菌生長曲線的影響26-27
• 2.2 沙門菌-斑馬魚感染模型適宜菌量的確定27-28
• 2.3 沙門菌在斑馬魚體內的播散繁殖28-30
• 2.4 鼠傷寒沙門菌對斑馬魚感染模型自噬的影響30-31
• 2.5 Torin1 及 CQ 對沙門菌-斑馬魚感染模型自噬的影響31-34
• 3. 討論34-37
• 第二部分 斑馬魚模型用于沙門菌質粒毒力基因 spv 對感染及自噬影響的研究·37-51
• 1. 材料與方法38-41
• 1.1 材料38
• 1.2 方法38-41
• 1.3 統(tǒng)計學處理41
• 2. 結果41-48
• 2.1 紅色熒光菌 RFP-STM-WT 和 RFP-STM-Δspv 的構建41-43
• 2.2 沙門菌質粒毒力基因 spv 影響斑馬魚半數致死量 LD_(50)43-44
• 2.3 沙門菌質粒毒力基因 spv 對細菌在斑馬魚體內繁殖播散的影響44-45
• 2.4 沙門菌質粒毒力基因 spv 對沙門菌-斑馬魚感染模型自噬的影響45-48
• 3. 討論48-51
• 小結51-52
• 參考文獻52-56
• 綜述56-68
• 參考文獻64-68
• 攻讀學位期間本人出版或公開發(fā)表的論著、論文68
• 本課題所獲的基金資助68-69
• 英文縮略詞表69-71
• 致謝71-73

【參考文獻】

中國期刊全文數據庫 前3條

1 郭恩棉;;斑馬魚卵巢發(fā)育的組織學研究[J];青島農業(yè)大學學報(自然科學版);2009年03期

2 李瓊;吳淑燕;黃瑞;;自噬在細菌感染與免疫應答中的作用[J];微生物與感染;2009年02期

3 賈順姬;孟安明;;中國斑馬魚研究發(fā)展歷程及現狀[J];遺傳;2012年09期

  本文關鍵詞：斑馬魚模型用于沙門菌質粒毒力基因spv對感染及自噬影響的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：482802