本文關(guān)鍵詞：斑馬魚(yú)模型用于沙門(mén)菌質(zhì)粒毒力基因spv對(duì)感染及自噬影響的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的： 幼年斑馬魚(yú)通體透明，用熒光菌感染后可在熒光顯微鏡下動(dòng)態(tài)追蹤細(xì)菌的分布與播散，是研究病原菌與宿主相互作用的理想模式生物。為研究鼠傷寒沙門(mén)菌（Salmonella enterica serovar typhimurium，S.typhimurium，STM）感染后對(duì)斑馬魚(yú)自噬的影響，本研究第一部分構(gòu)建沙門(mén)菌-斑馬魚(yú)感染模型。為研究沙門(mén)菌質(zhì)粒毒力基因（Salmonella plasmid virulence genes，spv）增強(qiáng)宿主菌毒力的分子機(jī)制，第二部分以攜帶spv基因的鼠傷寒沙門(mén)菌野生株STM-WT和spv基因缺失突變株STM-Δspv感染斑馬魚(yú)，探討該基因?qū)Π唏R魚(yú)體內(nèi)感染及自噬的影響，為進(jìn)一步闡明沙門(mén)菌質(zhì)粒毒力基因的致病機(jī)制、防治沙門(mén)菌感染及新藥靶位的發(fā)現(xiàn)提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 1.沙門(mén)菌-斑馬魚(yú)感染模型的構(gòu)建及用于自噬的研究 (1)沙門(mén)菌-斑馬魚(yú)感染模型適宜菌量的確定 不同濃度鼠傷寒沙門(mén)菌UF110浸染受精后72h（hours post-fertilization，hpf）的幼年斑馬魚(yú)，統(tǒng)計(jì)斑馬魚(yú)7d內(nèi)的死亡數(shù)目并繪制存活率曲線以確定適宜的細(xì)菌感染量。 (2)沙門(mén)菌在斑馬魚(yú)體內(nèi)的播散繁殖 以綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）標(biāo)記的鼠傷寒沙門(mén)菌UF110感染72hpf幼年斑馬魚(yú)，熒光顯微鏡下觀察細(xì)菌在體內(nèi)的播散。分別收集感染后6、8、10、12、14、16和24h的斑馬魚(yú)進(jìn)行阿米卡星（Amikacin，AMK）殺菌實(shí)驗(yàn)。計(jì)數(shù)整條魚(yú)感染的細(xì)菌量和侵入斑馬魚(yú)細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌量，檢測(cè)細(xì)菌在體內(nèi)的繁殖情況。 (3)鼠傷寒沙門(mén)菌對(duì)斑馬魚(yú)感染模型自噬的影響 收集感染后6、8、10、12和14h的斑馬魚(yú)，蛋白免疫印跡（western-blotting，WB）檢測(cè)自噬標(biāo)志蛋白—微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅱ（microtubule-associated protein1light chain3-Ⅱ，Lc3-Ⅱ）及自噬底物蛋白p62的表達(dá)；透射電鏡（transmissionelectron microscope，TEM）觀察斑馬魚(yú)小腸上皮細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。 (4) Torin1及氯喹（chloroquine，CQ）對(duì)沙門(mén)菌-斑馬魚(yú)感染模型自噬的影響 為探討自噬激動(dòng)劑Torin1和溶酶體抑制劑CQ對(duì)斑馬魚(yú)感染模型的作用，，本研究首先測(cè)定藥物對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)曲線及斑馬魚(yú)存活率的影響，并用WB檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)以確定Torin1及CQ的適宜工作濃度。分別以適宜濃度的Torin1和CQ單獨(dú)及共同預(yù)處理斑馬魚(yú)后與受試菌共培養(yǎng)，收集感染后的斑馬魚(yú)進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，WB檢測(cè)Lc3-Ⅱ和p62的表達(dá)。 2.斑馬魚(yú)模型用于沙門(mén)菌質(zhì)粒毒力基因spv對(duì)感染及自噬影響的研究 (1)紅色熒光菌的構(gòu)建 在綠色激發(fā)光下斑馬魚(yú)卵黃囊背景較強(qiáng)難以辨認(rèn)，為降低背景光的干擾，首先構(gòu)建背景干擾較小的紅色熒光菌。將表達(dá)紅色熒光蛋白（red fluorescent protein，RFP）的質(zhì)粒pGMDs3用CaCl2轉(zhuǎn)化法分別導(dǎo)入攜帶spv基因的野生株STM-WT和spv基因缺失突變株STM-Δspv，熒光顯微鏡鑒定后，活體成像儀觀察細(xì)菌發(fā)光情況，確定熒光強(qiáng)度與細(xì)菌數(shù)量的關(guān)系，并檢測(cè)RFP對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的影響。 (2)沙門(mén)菌質(zhì)粒毒力基因spv對(duì)斑馬魚(yú)半數(shù)致死量LD50的影響 用不同濃度STM-WT和STM-Δspv感染斑馬魚(yú)后，統(tǒng)計(jì)斑馬魚(yú)7d內(nèi)的死亡數(shù)目，用Reed-Muench法計(jì)算受試菌對(duì)斑馬魚(yú)的LD50。 (3)沙門(mén)菌質(zhì)粒毒力基因spv對(duì)細(xì)菌在斑馬魚(yú)體內(nèi)繁殖播散的影響 將STM-WT和STM-Δspv分別感染斑馬魚(yú)不同時(shí)間后，熒光顯微鏡下比較受試菌在體內(nèi)的播散。收集感染后4、8、12、16和24h的斑馬魚(yú)進(jìn)行AMK殺菌實(shí)驗(yàn)，比較兩株菌感染整條魚(yú)的細(xì)菌量及侵入斑馬魚(yú)細(xì)胞內(nèi)菌量的差異。 (4)沙門(mén)菌質(zhì)粒毒力基因spv對(duì)斑馬魚(yú)感染模型自噬的影響 將STM-WT和STM-Δspv分別感染斑馬魚(yú)不同時(shí)間后，WB檢測(cè)自噬標(biāo)志蛋白Lc3-Ⅱ和自噬底物蛋白p62的表達(dá)；Torin1和CQ單獨(dú)預(yù)處理斑馬魚(yú)24h后，分別與兩株受試菌共作用8h，WB檢測(cè)干預(yù)后Lc3-Ⅱ和p62的表達(dá)并計(jì)數(shù)藥物干預(yù)后細(xì)胞內(nèi)活菌數(shù)。 結(jié)果： 1.沙門(mén)菌-斑馬魚(yú)感染模型的構(gòu)建及對(duì)自噬的研究 (1)沙門(mén)菌-斑馬魚(yú)感染模型適宜菌量的確定：109cfu/ml細(xì)菌量感染斑馬魚(yú)后，兩天內(nèi)對(duì)其無(wú)顯著影響，感染后3d出現(xiàn)尾巴卷曲、游動(dòng)時(shí)協(xié)調(diào)性和靈活能力下降的情況,并出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。依據(jù)研究目的，自噬是發(fā)生在感染早期的事件，選擇感染后兩天內(nèi)對(duì)斑馬魚(yú)存活無(wú)顯著影響的109cfu/ml為后續(xù)實(shí)驗(yàn)用菌量。 (2)沙門(mén)菌在斑馬魚(yú)體內(nèi)的播散繁殖：熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)，感染后4h（hourspost infection，hpi）斑馬魚(yú)口周及卵黃囊中均有細(xì)菌侵入，8hpi斑馬魚(yú)腸道中可檢測(cè)到細(xì)菌信號(hào)。此后細(xì)菌逐漸播散，1d后眼睛周?chē)邦^部出現(xiàn)綠色熒光信號(hào)，2d后播散至斑馬魚(yú)整個(gè)頭部，3d后遍布全身。細(xì)菌計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，未加AMK組整條魚(yú)感染的細(xì)菌量隨時(shí)間進(jìn)行而增加，10hpi感染的細(xì)菌量顯著高于8hpi感染菌量(p0.001)；加入AMK殺死胞外菌后，細(xì)菌量明顯降低，且10hpi魚(yú)體中侵入細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌量顯著低于8hpi胞內(nèi)菌量(p0.001)。 (3)鼠傷寒沙門(mén)菌對(duì)斑馬魚(yú)感染模型自噬的影響：WB結(jié)果顯示，細(xì)菌感染斑馬魚(yú)8h后，自噬標(biāo)志蛋白Lc3-Ⅱ的表達(dá)顯著高于對(duì)照組及其余時(shí)間點(diǎn)(p0.001)，自噬底物蛋白p62的表達(dá)則顯著降低(p0.01)；10hpi上述趨勢(shì)仍存在(p0.05)。TEM結(jié)果顯示，8hpi幼魚(yú)腸道可觀察到腫脹的線粒體結(jié)構(gòu)，同時(shí)還見(jiàn)包裹著細(xì)菌的雙層膜自噬體結(jié)構(gòu)和降解內(nèi)容物的單層膜溶酶體結(jié)構(gòu)。 (4) Torin1和CQ對(duì)沙門(mén)菌-斑馬魚(yú)感染模型自噬的影響：0.4μmol/L Torin1作用斑馬魚(yú)24h后，斑馬魚(yú)存活率為100%，Lc3-Ⅱ表達(dá)水平最高(p0.001)；50μmol/LCQ作用斑馬魚(yú)24h后，斑馬魚(yú)未出現(xiàn)死亡，且p62表達(dá)水平顯著增高(p0.01)。細(xì)菌計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，Torin1處理組細(xì)菌數(shù)目顯著降低(p0.01)，而CQ處理組(p0.05)和兩種藥物共處理組(p0.001)細(xì)菌數(shù)目均增加。WB結(jié)果表明，與正常感染組相比，Torin1處理組Lc3-Ⅱ表達(dá)水平顯著升高(p0.01)，p62表達(dá)水平顯著降低(p0.01)；CQ處理組(p0.01)與兩種藥物共處理組(p0.001)，Lc3-Ⅱ與p62表達(dá)水平均顯著增加。 2.斑馬魚(yú)感染模型用于沙門(mén)菌質(zhì)粒毒力基因spv對(duì)感染及自噬影響的研究 (1)紅色熒光菌的構(gòu)建：在熒光顯微鏡下可觀察到紅色桿狀細(xì)菌，其熒光強(qiáng)度與細(xì)菌數(shù)量呈線性正相關(guān)；紅色熒光蛋白R(shí)FP對(duì)細(xì)菌24h內(nèi)生長(zhǎng)曲線未見(jiàn)顯著影響。 (2)沙門(mén)菌質(zhì)粒毒力基因spv對(duì)斑馬魚(yú)半數(shù)致死量LD50的影響：野生株STM-WT的LD50為1.17×107cfu/ml，突變株STM-Δspv的LD50為1.95×108cfu/ml，說(shuō)明spv能顯著降低宿主菌對(duì)斑馬魚(yú)的LD50。 (3)沙門(mén)菌質(zhì)粒毒力基因spv對(duì)細(xì)菌在斑馬魚(yú)體內(nèi)繁殖播散的影響 熒光顯微鏡檢測(cè)結(jié)果顯示，感染后4~6h，野生株STM-WT和突變株STM-Δspv感染組斑馬魚(yú)口周均可檢測(cè)到發(fā)光菌；8h后兩組斑馬魚(yú)腸道中均可檢測(cè)到紅色熒光菌，且STM-WT感染組熒光強(qiáng)度高于STM-Δspv感染組。隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，STM-WT在斑馬魚(yú)體內(nèi)的繁殖和擴(kuò)散速度較快，2d已播散至全身；而STM-Δspv繁殖和擴(kuò)散程度較慢，直至3d播散至全身。細(xì)菌計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，STM-WT感染組整條魚(yú)感染的細(xì)菌量在同一感染時(shí)間點(diǎn)顯著高于STM-Δspv感染組（p0.05，p0.01）；加入AMK殺死胞外菌后，細(xì)菌量明顯降低，但STM-WT感染組侵入魚(yú)體細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌量仍顯著高于STM-Δspv感染組（p0.01，p0.001）。 (4)沙門(mén)菌質(zhì)粒毒力基因spv對(duì)斑馬魚(yú)感染模型自噬的影響 WB檢測(cè)自噬標(biāo)志蛋白Lc3-Ⅱ和自噬底物蛋白p62結(jié)果顯示，細(xì)菌感染斑馬魚(yú)8h后，野生株STM-WT感染組Lc3-Ⅱ表達(dá)水平顯著低于spv基因缺失突變株STM-Δspv感染組（p0.01），而p62表達(dá)水平顯著升高（p0.01）。10h依然保持上述趨勢(shì)（Lc3-Ⅱ，p0.01；p62，p0.05），但6h未見(jiàn)明顯差異（p0.05）。Torin1干預(yù)后，STM-WT感染組Lc3-Ⅱ水平提高（p0.05），但與STM-Δspv感染組間無(wú)顯著差異（p0.05）；CQ干預(yù)后，各組Lc3-Ⅱ水平均有所提高（p0.01），且STM-WT感染組仍低于STM-Δspv感染組（p0.01）；各組p62水平也顯著增高（p0.01），但各感染組間無(wú)顯著差異（p0.05）。細(xì)菌計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，感染8h后，STM-WT感染組胞內(nèi)CFU顯著高于STM-Δspv感染組（p0.01）；Torin1干預(yù)后，兩組胞內(nèi)CFU均有減少，且兩組間差異減�。╬0.05）；CQ干預(yù)后，兩組胞內(nèi)CFU無(wú)顯著差異（p0.05）。 結(jié)論： 1.成功構(gòu)建了可用于研究自噬的沙門(mén)菌-斑馬魚(yú)感染模型。 2.自噬具有保守性，Torin1和CQ對(duì)斑馬魚(yú)自噬的影響與對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞自噬的影響相似。 3.沙門(mén)菌質(zhì)粒毒力基因spv可增強(qiáng)鼠傷寒沙門(mén)菌對(duì)斑馬魚(yú)的毒力，促進(jìn)宿主菌在體內(nèi)的繁殖和播散，從而加重感染。spv對(duì)鼠傷寒沙門(mén)菌所致的斑馬魚(yú)異源自噬具有抑制作用，CQ干預(yù)結(jié)果顯示，其作用時(shí)相早于溶酶體降解過(guò)程，在早期自噬體形成階段。
【關(guān)鍵詞】：斑馬魚(yú) 鼠傷寒沙門(mén)菌 spv 自噬
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R378.22
【目錄】：

• 中文提要4-9
• Abstract9-16
• 引言16-20
• 第一部分 沙門(mén)菌-斑馬魚(yú)感染模型的構(gòu)建及用于自噬的研究20-37
• 1. 材料與方法20-26
• 1.1 材料20-23
• 1.2 方法23-26
• 1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理26
• 2. 結(jié)果26-34
• 2.1 溫度與 GFP 對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的影響26-27
• 2.2 沙門(mén)菌-斑馬魚(yú)感染模型適宜菌量的確定27-28
• 2.3 沙門(mén)菌在斑馬魚(yú)體內(nèi)的播散繁殖28-30
• 2.4 鼠傷寒沙門(mén)菌對(duì)斑馬魚(yú)感染模型自噬的影響30-31
• 2.5 Torin1 及 CQ 對(duì)沙門(mén)菌-斑馬魚(yú)感染模型自噬的影響31-34
• 3. 討論34-37
• 第二部分 斑馬魚(yú)模型用于沙門(mén)菌質(zhì)粒毒力基因 spv 對(duì)感染及自噬影響的研究·37-51
• 1. 材料與方法38-41
• 1.1 材料38
• 1.2 方法38-41
• 1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理41
• 2. 結(jié)果41-48
• 2.1 紅色熒光菌 RFP-STM-WT 和 RFP-STM-Δspv 的構(gòu)建41-43
• 2.2 沙門(mén)菌質(zhì)粒毒力基因 spv 影響斑馬魚(yú)半數(shù)致死量 LD_(50)43-44
• 2.3 沙門(mén)菌質(zhì)粒毒力基因 spv 對(duì)細(xì)菌在斑馬魚(yú)體內(nèi)繁殖播散的影響44-45
• 2.4 沙門(mén)菌質(zhì)粒毒力基因 spv 對(duì)沙門(mén)菌-斑馬魚(yú)感染模型自噬的影響45-48
• 3. 討論48-51
• 小結(jié)51-52
• 參考文獻(xiàn)52-56
• 綜述56-68
• 參考文獻(xiàn)64-68
• 攻讀學(xué)位期間本人出版或公開(kāi)發(fā)表的論著、論文68
• 本課題所獲的基金資助68-69
• 英文縮略詞表69-71
• 致謝71-73

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

1 郭恩棉;;斑馬魚(yú)卵巢發(fā)育的組織學(xué)研究[J];青島農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2009年03期

2 李瓊;吳淑燕;黃瑞;;自噬在細(xì)菌感染與免疫應(yīng)答中的作用[J];微生物與感染;2009年02期

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  本文關(guān)鍵詞：斑馬魚(yú)模型用于沙門(mén)菌質(zhì)粒毒力基因spv對(duì)感染及自噬影響的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：482802