本文關(guān)鍵詞：Saos-2細(xì)胞和U2-OS細(xì)胞基質(zhì)小泡比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：成骨細(xì)胞是骨形成的主要功能細(xì)胞，在細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix, ECM）的合成、分泌和礦化過(guò)程中發(fā)揮重要作用，可分泌類骨質(zhì)包被自身從而轉(zhuǎn)變?yōu)楣羌?xì)胞。除了類骨質(zhì)外，成骨細(xì)胞還可分泌基質(zhì)小泡（matrix vesicles, MV）。MV主要分布在骨、軟骨和牙本質(zhì)的基質(zhì)中，有膜包被，富含Ca2+和PO43+，內(nèi)有細(xì)小的鈣化結(jié)晶，富含多種磷脂和蛋白，在骨礦化過(guò)程起始階段起著重要作用。MV可以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外基質(zhì)中的磷酸鹽（Pi）和無(wú)機(jī)焦磷酸磷酸鹽（PPi）的比例，促進(jìn)礦化物形成，一般被認(rèn)為是鈣化的起始部位。在骨礦化過(guò)程中，MV中的鈣化結(jié)晶釋放到成骨細(xì)胞分泌的類骨質(zhì)，形成羥基磷灰石（hydroxyapatite, HA）。HA在軟骨或成骨細(xì)胞的ECM膠原纖維中的沉積，促進(jìn)了軟骨或骨的礦化。 對(duì)MV表面受體、離子通道和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與礦化進(jìn)程的研究也發(fā)現(xiàn)，MV蛋白可調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外基質(zhì)中的Pi與PPi比例，結(jié)合鈣離子，抑制鈣化或充當(dāng)成核因子，提供HA成核位點(diǎn)，對(duì)正常骨礦化進(jìn)程起到重要作用，其異常則可能導(dǎo)致礦化物聚集或礦化不足。MV蛋白突變可能從無(wú)機(jī)離子的比例、酶的活性及成核位點(diǎn)的形成等多方面影響礦化，產(chǎn)生不同程度的礦化異常，導(dǎo)致異位礦化或礦化不足類疾病，而這些疾病在臨床上是廣泛存在的。因此，對(duì)MV參與礦化機(jī)制的研究具有重要的臨床意義和生物學(xué)意義，從MV水平尋找調(diào)節(jié)礦化的調(diào)控因子，可能為病理性礦化的機(jī)制研究和治療提供理論基礎(chǔ)和臨床依據(jù)。目前認(rèn)為，MV對(duì)鈣化的促進(jìn)至少有兩大作用1）MV酶可以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外的Pi/PPi比例；2）MV蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，包括酸性磷脂，可作為HA沉積形成的初始晶核。目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究已發(fā)現(xiàn)2000多種與礦化相關(guān)的MV蛋白。大量研究表明， MV蛋白缺乏可能與許多罕見(jiàn)的骨骼類疾病的病理礦化進(jìn)程密切相關(guān)，然而絕大對(duì)數(shù)蛋白在礦化中所起的調(diào)節(jié)作用目前仍不明確。 U2-OS細(xì)胞是一種低磷酸酯酶活性、礦化能力缺陷的成骨細(xì)胞，而Saos-2細(xì)胞是一種具有顯著礦化能力的成骨細(xì)胞。上述兩種細(xì)胞均屬人骨肉瘤細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)室分別從礦化誘導(dǎo)的Saos-2細(xì)胞和U2-OS細(xì)胞的ECM中提取MV，然后進(jìn)行比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析，以期發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的MV蛋白。 目的：培養(yǎng)礦化能力明顯差異的骨肉瘤細(xì)胞Saos-2和U2-OS，用礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)細(xì)胞，提取細(xì)胞分泌的基質(zhì)小泡并進(jìn)行鑒定。比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析MV蛋白，尋找骨礦化相關(guān)的差異蛋白，為探索MV在礦化進(jìn)程中的作用提供新的線索。 方法：用含10mM β-磷酸甘油、50μg/mLVc的DMEM和Mccoy′s5AMedium誘導(dǎo)培養(yǎng)Saos-2和U2-OS細(xì)胞。分別提取Saos-2和U2-OS細(xì)胞基質(zhì)小泡，并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)和電鏡技術(shù)鑒定所提取的MV，對(duì)MV蛋白進(jìn)行比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析；使用MAS3.0分析軟件對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)分析所得的差異蛋白作進(jìn)一步分析；篩選出的差異蛋白經(jīng)western-blotting進(jìn)行再驗(yàn)證。 結(jié)果：從Saos-2和U2-OS細(xì)胞中均成功提取獲得MV。經(jīng)電鏡和流式細(xì)胞儀檢測(cè)，，可觀察到本實(shí)驗(yàn)室所提取的沉淀直徑為50-200nm的小囊泡，并且正常的Saos-2和U2-OS細(xì)胞以及礦化誘導(dǎo)7天的U2-OS細(xì)胞的提取物中均未發(fā)現(xiàn)礦化物結(jié)晶，而在礦化誘導(dǎo)7天的Saos-2細(xì)胞的提取物中存在包含于囊泡中的礦化物結(jié)晶。我們對(duì)這兩種細(xì)胞的MV進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，共發(fā)現(xiàn)175種骨礦化相關(guān)的差異表達(dá)蛋白（表達(dá)量比值2），包括89種上調(diào)表達(dá)蛋白和86種下調(diào)表達(dá)蛋白（Saos-2/U2-OS）。我們使用MAS3.0在線分析軟件對(duì)89種上調(diào)表達(dá)蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)12例鈣結(jié)合蛋白，8例參與了骨相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的蛋白。選取蛋白激酶C-α（proteinKinase C α，PKCα）和RAS相關(guān)蛋白R(shí)al-A（ras-related protein Ral-A，Rala）兩種表達(dá)上調(diào)的差異蛋白進(jìn)行western-blotting驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)與蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果基本一致。 結(jié)論：誘導(dǎo)礦化7天的Saos-2和U2-OS細(xì)胞呈現(xiàn)明顯差異的礦化現(xiàn)象，提取的基質(zhì)小泡經(jīng)電鏡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)礦化誘導(dǎo)7天的Saos-2細(xì)胞MV中有礦化結(jié)節(jié)的存在，而礦化誘導(dǎo)7天的U2-OS細(xì)胞MV中則未觀察到礦化結(jié)節(jié)的存在。這個(gè)結(jié)果從一定程度上表明了，MV為成骨細(xì)胞骨礦化提供了成核位點(diǎn)，可能是骨礦化的起始位置。對(duì)這兩種礦化能力有明顯差異的成骨細(xì)胞MV進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，篩選與礦化相關(guān)的差異蛋白，為探討MV蛋白在礦化過(guò)程中所發(fā)揮的作用和初步探索MV在骨礦化過(guò)程中的作用機(jī)制提供了一定的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：基質(zhì)小泡 成骨細(xì)胞 礦化 蛋白質(zhì)組學(xué)
【學(xué)位授予單位】：濟(jì)南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R329.2
【目錄】：

• 導(dǎo)師簡(jiǎn)介5
• 課題組成5-8
• 摘要8-11
• Abstract11-14
• 英文縮略詞表14-15
• 第一章 前言15-22
• 1.1 基質(zhì)小泡的定義15-17
• 1.2 基質(zhì)小泡主要蛋白與礦化形成的關(guān)系17-21
• 1.3 總結(jié)21-22
• 第二章 SAOS-2 和 U2-OS 細(xì)胞培養(yǎng)和基質(zhì)小泡的提取及鑒定22-29
• 2.1 材料22
• 2.1.1 細(xì)胞22
• 2.1.2 主要試劑22
• 2.1.3 主要儀器22
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法22-25
• 2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)22-23
• 2.2.2 細(xì)胞的誘導(dǎo)條件和方法23
• 2.2.3 SAOS-2 和 U2-OS 細(xì)胞礦化的茜素紅檢測(cè)23-24
• 2.2.4 基質(zhì)小泡的提取24
• 2.2.5 基質(zhì)小泡的電鏡鑒定24
• 2.2.6 基質(zhì)小泡的流式細(xì)胞儀鑒定24-25
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果25-28
• 2.3.1 SAOS-2 和 U2-OS 細(xì)胞礦化誘導(dǎo)的茜素紅檢測(cè)結(jié)果25-26
• 2.3.2 基質(zhì)小泡的提取結(jié)果26
• 2.3.3 基質(zhì)小泡的電鏡鑒定結(jié)果26-27
• 2.3.4 基質(zhì)小泡的流式細(xì)胞儀鑒定結(jié)果27-28
• 2.4 討論28-29
• 第三章 基質(zhì)小泡蛋白質(zhì)組學(xué)29-38
• 3.1 材料29
• 3.1.1 主要試劑29
• 3.1.2 主要儀器29
• 3.2 基質(zhì)小泡蛋白的非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析29-31
• 3.2.1 蛋白質(zhì)的提取和定量29
• 3.2.2 SDS-PAGE 試驗(yàn)29
• 3.2.3 FASP 酶解蛋白29-30
• 3.2.4 MV 蛋白的 LCMS/MS 分析30
• 3.2.5 質(zhì)譜數(shù)據(jù)的非標(biāo)記定量分析30-31
• 3.2.6 MV 蛋白表達(dá)譜的生物信息學(xué)分析31
• 3.3 差異表達(dá)蛋白的篩選31
• 3.4 免疫印跡法驗(yàn)證差異表達(dá)蛋白31-33
• 3.4.1 提取總蛋白31
• 3.4.2 蛋白定量31
• 3.4.3 SDS-PAGE 電泳31-32
• 3.4.4 半干法轉(zhuǎn)膜32
• 3.4.5 封閉32
• 3.4.6 雜交一抗32
• 3.4.7 洗膜32-33
• 3.4.8 雜交二抗33
• 3.4.9 洗膜33
• 3.4.10 檢測(cè)33
• 3.4.11 成像33
• 3.5 結(jié)果33-36
• 3.5.1 基質(zhì)小泡蛋白的質(zhì)譜分析結(jié)果33
• 3.5.2 差異蛋白的生物信息學(xué)分析和免疫印跡驗(yàn)證結(jié)果33-36
• 3.6 實(shí)驗(yàn)討論36-38
• 參考文獻(xiàn)38-41
• 附錄41-66
• 文獻(xiàn)綜述66-77
• 參考文獻(xiàn)74-77
• 已發(fā)表論文77-78
• 致謝78

【共引文獻(xiàn)】

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中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前4條

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3 高Z

本文編號(hào)：477780