本文關(guān)鍵詞：人源抗EV71病毒Fab噬菌體抗體庫的構(gòu)建和篩選，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的本研究采用噬菌體表面展示技術(shù)進(jìn)行人源抗EV71病毒Fab噬菌體抗體庫的構(gòu)建和篩選，目的在于獲得特異性針對EV71病毒、具有中和活性的人源性單克隆抗體，為EV71感染引起的手足口病的臨床防治提供備擇方案。方法采集16名志愿者外周血，利用間接免疫熒光（IFA）法檢測血清抗體，并利用中和實驗檢測血清EV71病毒中和抗體滴度，篩選出EV71病毒血清中和抗體效價為1:128的成人的外周血，分離其淋巴細(xì)胞，提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，運(yùn)用人源抗體Fab段基因引物擴(kuò)增出人源抗體輕鏈及重鏈Fd區(qū)，分步克隆至pComb3載體，并驗證輕、重鏈插入率。使用輔助噬菌體VCSM13感染重組大腸桿菌XL1-Blue，，對Fab噬菌體抗體庫進(jìn)行包裝。在此基礎(chǔ)上，以EV71病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1上的中和線性表位SP70為抗原對Fab噬菌體抗體庫進(jìn)行富集篩選，經(jīng)過三輪“吸附-洗脫-富集”的過程后，將獲得的重組噬菌體感染大腸桿菌XL1-Blue并誘導(dǎo)表達(dá)，利用SP70包被高吸附96孔板，對誘導(dǎo)表達(dá)后的菌上清進(jìn)行篩選。結(jié)果（1）所構(gòu)建的重組載體的輕、重鏈插入率均接近100%，所構(gòu)建的Fab噬菌體抗體庫的庫容可達(dá)到108，滿足抗EV71病毒Fab抗體篩選所需。（2）經(jīng)過三輪“吸附-洗脫-富集”的過程，共獲得51株表達(dá)具有SP70多肽特異性結(jié)合活性及Fab活性重組蛋白的克隆，通過序列測定確定其基因序列，與Internet V-Base基因庫比對確定IgG家族，與IMGT/V-QUEST數(shù)據(jù)庫比對，確定51株陽性克隆的抗體輕、重鏈型別。結(jié)果顯示共獲得了3株輕、重鏈基因組合序列不相同的克隆株。ELISA實驗進(jìn)一步證明了這3株Fab抗體可特異性結(jié)合SP70多肽。結(jié)論本研究運(yùn)用噬菌體抗體庫技術(shù)，成功構(gòu)建了人源抗EV71病毒Fab噬菌體抗體庫，并從中篩選出了3株特異性針對EV71病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1上的中和線性表位SP70的人源Fab抗體。
【關(guān)鍵詞】：人源化抗體 抗體Fab段 噬菌體抗體庫 EV71
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R392
【目錄】：

• 英文縮略詞表4-6
• 中文摘要6-7
• 英文摘要7-8
• 第一部分：人源抗 EV71 病毒 Fab 噬菌體抗體庫的構(gòu)建8-32
• 前言8-10
• 材料與方法10-23
• 結(jié)果23-29
• 討論29-32
• 第二部分：人源抗 EV71 病毒 Fab 噬菌體抗體庫的篩選32-43
• 前言32-33
• 材料與方法33-38
• 結(jié)果38-41
• 討論41-43
• 結(jié)論43-44
• 參考文獻(xiàn)44-47
• 致謝47-48
• 文獻(xiàn)綜述48-55
• 參考文獻(xiàn)53-55

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 萬瑛,代佳平,王燕,劉昕;一種穩(wěn)定、易于操作的噬菌體隨機(jī)肽庫載體的構(gòu)建[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;1999年04期

2 侯云霞,董文其,王萍;噬菌體抗體庫技術(shù)應(yīng)用中的幾個問題及其對策[J];第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2002年04期

3 王淑華;張九菊;李瓊;;EV71感染手足口病的流行概況及臨床表現(xiàn)[J];中國兒童保健雜志;2012年03期

4 閻錫蘊(yùn),田波;人抗體庫技術(shù)[J];科學(xué)通報;1997年12期

5 趙慧斌;噬菌體抗體庫篩選技術(shù)[J];臨床檢驗雜志;2004年02期

6 張建瓊,張雪萍,謝維,單祥年,林陵;高效電轉(zhuǎn)化率條件的探索[J];南京師大學(xué)報(自然科學(xué)版);2000年02期

7 戴和平,高宏,趙新顏;噬菌體展示技術(shù)的原理和方法[J];水生生物學(xué)報;2002年04期

8 王乃東;袁安文;薛立群;;鏈替換技術(shù)提高噬菌體抗體親和力的研究進(jìn)展[J];生物技術(shù)通報;2010年08期

9 張春莉;抗體庫技術(shù)[J];微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展;2001年04期

10 黃儀秀,朱圣庚;絲狀噬菌體與噬菌體展示技術(shù)[J];微生物學(xué)通報;1997年05期

  本文關(guān)鍵詞：人源抗EV71病毒Fab噬菌體抗體庫的構(gòu)建和篩選，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：477238