發(fā)布時間：2017-06-23 19:15

  本文關(guān)鍵詞：解脲支原體MB抗原保守區(qū)的基因克隆、表達及其單克隆抗體的制備，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：解脲支原體在成年人下生殖道中的定植率為40-80%,通常情況下并不致病,但在一些特定情況下解脲支原體可以引起非淋病性尿道炎、前列腺炎、不孕、早產(chǎn)、胎兒體重偏輕和呼吸道疾病。在過去的50年里,研究者使用動物模型、人體實驗、流行病學(xué)調(diào)查等來分析解脲支原體與這些疾病之間的關(guān)系,但并沒有得到明確結(jié)論。推斷解脲支原體相關(guān)疾病可能由多種因素引起,患者的免疫力、解脲支原體的種類、抗原變異等因素在疾病的發(fā)展過程中可能發(fā)揮重要作用。發(fā)展一種快速檢測解脲支原體感染的方法將極有利于解脲支原體有關(guān)疾病的明確診斷和有效防治。本研究通過基因克隆表達獲得解脲支原體表面抗原MB保守區(qū),并制備針對MB抗原的特異性抗體,為開發(fā)檢測解脲支原體的膠體金免疫層析試紙條奠定基礎(chǔ)。 研究內(nèi)容分以下兩個部分： 一、解脲支原體MB抗原保守區(qū)的原核表達和抗原性分析 為了獲得解脲支原體MB抗原保守區(qū),通過EBI在線分析解脲支原體14個血清型MB抗原基因,找出同源性最高的基因片段,此片段含294個堿基序列。為了制備用于免疫小鼠的MB抗原和用于篩選抗體的檢測性MB抗原,利用Oligo軟件設(shè)計了兩對引物,用PCR擴增出這段保守基因,分別克隆進pGEX-4T-1和pET-30a載體,得到原核表達載體pGEX-4T-MB和pET-30a-MB。在大腸桿菌BL21(DE3)中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達獲得37kDa的GST-MB和11kDa的His-MB兩種融合蛋白。使用蛋白純化儀分別純化這兩種融合蛋白,兩種融合蛋白的純化效率分別是92.7%和86.7%。用His-MB融合蛋白免疫小鼠制備多抗血清,間接ELISA檢測制備的重組蛋白是否有免疫活性。結(jié)果顯示免疫血清與常用的商品化MB抗原和本研究制備的重組GST-MB均能有效反應(yīng),特異性抗體效價在1:6400-1:12800間。同時,多抗血清也能夠與血清三型解脲支原體特異性結(jié)合。 二、解脲支原體MB抗原單克隆抗體制備 為制備可用于檢測解脲支原體表面抗原的單克隆抗體,用第一部分制備的His-MB融合蛋白免疫小鼠,經(jīng)三次皮下多點免疫和一次尾靜脈注射加強免疫后,取脾臟細胞與骨髓瘤細胞SP2/0融合,間接ELISA檢測融合細胞的培養(yǎng)上清。采用有限稀釋法對ELISA檢測結(jié)果陽性的融合細胞進行克隆化,經(jīng)三次亞克隆后,獲得三株能穩(wěn)定分泌抗MB McAb的雜交瘤細胞。秋水仙素處理雜交瘤細胞,吉姆薩染色顯示雜交瘤細胞的染色體數(shù)目在95-105間。三株細胞分別制備腹水,初步檢測表明腹水中含有相應(yīng)抗體,腹水效價在1:320000左右,亞類鑒定結(jié)果表明三株單抗的重鏈均為IgGl, Western-blot結(jié)果顯示,抗體和融合蛋白GST-MB可以發(fā)生特異性結(jié)合。以制備的多抗和單抗為一抗,間接ELISA檢測50例臨床尿液樣本,與液體培養(yǎng)法相比,單抗檢測的陽性率較低,統(tǒng)計學(xué)分析顯示P0.05,存在顯著差異；而使用多抗檢測的準確率與液體培養(yǎng)法相近,P0.05,兩種方法無顯著差異。
【關(guān)鍵詞】：解脲支原體 MB抗原 非淋病性尿道炎 單克隆抗體
【學(xué)位授予單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R392
【目錄】：

• 符號說明4-6
• 中文摘要6-8
• Abstract8-10
• 文獻綜述：解脲支原體感染及其診斷技術(shù)研究進展10-19
• 一、臨床危害10-11
• 二、常規(guī)實驗室診斷方法11-13
• 三、膠體金免疫層析技術(shù)13-15
• 參考文獻15-19
• 研究內(nèi)容一：解脲支原體MB抗原保守區(qū)的原核表達和抗原性分析19-30
• 1 材料和方法19-23
• 2 結(jié)果23-28
• 3 討論28-29
• 參考文獻29-30
• 研究內(nèi)容二：解脲支原體MB抗原單克隆抗體制備30-40
• 1 材料和方法30-35
• 2 結(jié)果35-37
• 3 討論37-38
• 參考文獻38-40
• 結(jié)論40-41
• 附錄：本文涉及的主要培養(yǎng)基及其試劑41-48
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文48
• 攻讀學(xué)位期間獲獎情況48-49
• 致謝49-50

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 林彤;獨軍政;叢國正;邵軍軍;高閃電;常惠蕓;謝慶閣;;膠體金標記免疫層析技術(shù)的最新應(yīng)用進展[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2010年16期

  本文關(guān)鍵詞：解脲支原體MB抗原保守區(qū)的基因克隆、表達及其單克隆抗體的制備，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：476055