本文關(guān)鍵詞：類鼻疽伯克霍爾德菌全基因組測序及感染細(xì)胞模型的建立，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：類鼻疽伯克霍爾德菌(B. pseudomallei)是一種革蘭氏陰性桿菌，1911年首次在緬甸仰光分離到，運(yùn)動活躍，可以通過氣溶膠的形式傳播。根據(jù)能否利用L-阿拉伯糖可以將其分為致病性和非致病性，不能利用L-阿拉伯糖的為致病性菌株。2006年美國CDC將其列為B類病原體，“9.11”之后美國更視其為生物恐怖劑。類鼻疽伯克霍爾德菌能導(dǎo)致一種危害嚴(yán)重的熱帶疾病，稱為類鼻疽，臨床表現(xiàn)為多發(fā)性膿腫，難治性肺炎和致死性的敗血癥，死亡率可達(dá)40%。我國海南、廣東、廣西和臺灣等地都是類鼻疽的疫源地。隨著地區(qū)輸入性病例的增多，該病原體越來越受到重視，但在中國類鼻疽的研究還亟待加強(qiáng)。 開展類鼻疽的研究首先需要具有參考價值的標(biāo)準(zhǔn)株，但是由于涉及生物安全和生物威脅，難于直接從國外獲取標(biāo)準(zhǔn)菌株�；蚪M測序是了解細(xì)菌遺傳背景的最本質(zhì)的方法。為此本研究篩選了一株臨床B. pseudomallei進(jìn)行全基因組測序并進(jìn)一步分析其基因組的特點(diǎn)，以形成我國B. pseudomallei標(biāo)準(zhǔn)株。 同時，建立B. pseudomallei感染細(xì)胞模型是研究細(xì)菌與宿主細(xì)胞相互作用的前提。本研究擬以完成測序的B. pseudomallei BPC006為感染細(xì)菌，通過優(yōu)化B. pseudomallei感染RAW264.7的各項(xiàng)參數(shù)，觀察細(xì)胞受B. pseudomallei感染后細(xì)胞形態(tài)的特殊變化，檢測宿主細(xì)胞的生化和免疫學(xué)指標(biāo)，以期建立穩(wěn)定的B. pseudomallei感染細(xì)胞模型。 方法 1.采用454測序儀對一株來自我國海南的B. pseudomallei BPC006進(jìn)行全基因組測序。調(diào)用Newbler2.3軟件、比照參考株B. pseudomallei strain1106a進(jìn)行參考拼接，PCR、ABI3730測序儀補(bǔ)全漏洞(gap)后進(jìn)行在線注釋、糾錯、提交、分析。 2.分別制備B. pseudomallei BPC006全菌超聲抗原、甲醛滅活全菌抗原及熱滅活全菌抗原，免疫BALB/c小鼠和家兔，制備其多抗血清。 3.通過透射電鏡和熒光標(biāo)記觀察胞內(nèi)細(xì)菌確認(rèn)B. pseudomallei胞內(nèi)感染，Giemsa染色和倒置顯微鏡動態(tài)觀察細(xì)胞融合和多核巨細(xì)胞(multinucleated giant cells，MNGC)形成規(guī)律，計算侵襲率和檢測促炎癥因子，評價模型穩(wěn)定性。 結(jié)果 1.完成了B. pseudomallei BPC006的全基因組序列測定，其序列號為：CP003781(1號染色體)和CP003782(2號染色體)，分析發(fā)現(xiàn)其基因組中有溶源性大片段的插入、缺失和突變，構(gòu)建類鼻疽伯克霍爾德菌的系統(tǒng)發(fā)生樹。 2. B. pseudomallei BPC006全菌免疫BALB/c小鼠和兔，ELISA和凝集效價高達(dá)1:64000和1:128，免疫熒光顯示制備的抗體能與胞內(nèi)B. pseudomallei BPC006菌體發(fā)生特異的抗原抗體反應(yīng)。 3. MOI=100時B. pseudomallei感染RAW264.7細(xì)胞，細(xì)菌在胞內(nèi)繁殖后促使細(xì)胞間發(fā)生融合，可見明顯的MNGC形成，，1～24h炎癥因子TNF-α呈“雙峰”變化。 結(jié)論 1.首次對中國B. pseudomallei臨床分離株進(jìn)行了全基因組測序，建立了B.pseudomallei研究的標(biāo)準(zhǔn)株，得到了臨床分離株B. pseudomallei BPC006的全序列，分析其遺傳特點(diǎn)，為后續(xù)的類鼻疽流行病學(xué)調(diào)查、診斷及預(yù)防靶點(diǎn)的篩選提供了依據(jù)。 2.制備了針對B. pseudomallei BPC006全菌的多抗血清，為后續(xù)病原體的診斷和細(xì)胞微生物學(xué)研究提供了有效的工具。 3.建立了穩(wěn)定的B. pseudomallei感染RAW264.7細(xì)胞模型，為研究病原菌與宿主細(xì)胞的相互作用奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：類鼻疽伯克霍爾德菌 全基因組測序 細(xì)胞模型
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R378
【目錄】：

• 縮略語表4-6
• Abstract6-8
• 摘要8-10
• 第一章 前言10-14
• 第二章 類鼻疽伯克霍爾德菌基因組測序14-43
• 2.1 材料與方法14-24
• 2.2 結(jié)果與分析24-41
• 2.3 討論41-43
• 第三章 類鼻疽伯克霍爾德菌感染 RAW264.7 細(xì)胞模型的建立43-57
• 3.1 材料與方法43-49
• 3.2 結(jié)果與分析49-55
• 3.3 討論55-57
• 全文總結(jié)57-58
• 本研究的不足與展望58-59
• 參考文獻(xiàn)59-67
• 文獻(xiàn)綜述一 類鼻疽的研究進(jìn)展及診療現(xiàn)狀67-73
• 參考文獻(xiàn)72-73
• 文獻(xiàn)綜述二 類鼻疽伯克霍爾德菌基因組學(xué)概述及進(jìn)展73-82
• 參考文獻(xiàn)80-82
• 附件82-85
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文及參與的課題85-86
• 致謝86

【相似文獻(xiàn)】

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1 陳海,楊小敏,王才春;類鼻疽伯克霍德菌敗血癥四例[J];中華傳染病雜志;2004年03期

2 莫成錦,王旭明,符惠群,谷海瀛;人的類鼻疽:我們必須警惕的感染性疾病[J];中國熱帶醫(yī)學(xué);2002年01期

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7 宋e�，陆振�

本文編號：467254