本文關(guān)鍵詞：基于人乳頭瘤病毒16型L2的新型宮頸癌預(yù)防性疫苗研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：宮頸癌是發(fā)病率僅次于乳腺癌的第二大婦科惡性腫瘤。目前的治療措施主要是根據(jù)癌癥分期選擇進(jìn)行手術(shù)及放化療，但治療費(fèi)用高，易復(fù)發(fā)。大量流行病學(xué)數(shù)據(jù)表明，高危型人乳頭瘤病毒（Humanpapillomavirus，HPV）與宮頸癌的發(fā)生密切關(guān)系，是導(dǎo)致宮頸癌的主要病因。因此，通過(guò)研發(fā)疫苗預(yù)防HPV的早期感染可能是目前降低宮頸癌發(fā)病率較為經(jīng)濟(jì)有效的策略。 目前，在歐美上市的的宮頸癌預(yù)防性疫苗是基于HPV主要衣殼蛋白L1的病毒樣顆粒（Virus-LikeParticles，VLPs）亞單位疫苗，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生型別特異性的中和抗體，不同型別之間鮮有交叉保護(hù)，但若通過(guò)增加價(jià)位來(lái)擴(kuò)大疫苗保護(hù)范圍則又會(huì)增加疫苗的安全風(fēng)險(xiǎn)。近來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，HPV次要衣殼蛋白L2的N端區(qū)域含有保守的共同表位，能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生具有交叉保護(hù)效力的中和抗體，是很有前景的新一代宮頸癌預(yù)防性疫苗。然而，HPVL2N段多肽免疫原性普遍偏低，這制約了該疫苗的進(jìn)一步應(yīng)用。 本課題將蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域多肽（Proteintransductiondomain，，PTD）作為多肽佐劑與不同的HPV16L2N端多肽片段以融合或混合的方式結(jié)合構(gòu)建了一系列重組蛋白疫苗；同時(shí)，我們還構(gòu)建了表達(dá)HPV16L2N段或全長(zhǎng)蛋白的重組腺病毒疫苗，并通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)重組蛋白疫苗和重組腺病毒疫苗的免疫效果進(jìn)行了系統(tǒng)評(píng)價(jià)。結(jié)果如下：（1）間接ELISA結(jié)果顯示，各重組蛋白疫苗均可誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗體，抗體滴度與疫苗抗原大小呈正相關(guān)。（2）假病毒顆粒中和實(shí)驗(yàn)顯示，PTD與HPV16L2N端多肽構(gòu)成的融合蛋白可以誘導(dǎo)產(chǎn)生較高滴度的交叉中和抗體，且可明顯提高中和抗體在總抗體中的比例。（3）含HPV16L2全長(zhǎng)基因的重組腺病毒既可誘導(dǎo)產(chǎn)生具有交叉保護(hù)效力的中和抗體，又可刺激產(chǎn)生特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答。 綜上，融合表達(dá)PTD可顯著提高L2N段多肽的免疫原性，其體液免疫增強(qiáng)效果與疫苗抗原大小呈正相關(guān)。L2重組腺病毒疫苗可刺激較好的細(xì)胞免疫應(yīng)答，兩種形式的疫苗結(jié)合使用將可提供更全面的保護(hù)效力。
【關(guān)鍵詞】：HPV16L2 PTD 重組腺病毒 宮頸癌 疫苗
【學(xué)位授予單位】：北京工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R737.33;R392
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-6
• 主要英文縮寫詞6-9
• 第1章 緒論9-15
• 1.1 HPV16L2及其研究現(xiàn)狀9-11
• 1.1.1 HPV與宮頸癌9-10
• 1.1.2 基于L2的疫苗研究進(jìn)展10-11
• 1.1.3 方向和展望11
• 1.2 蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域（PTD）的研究進(jìn)展11-12
• 1.3 本課題研究?jī)?nèi)容12-13
• 1.4 本課題技術(shù)路線13-15
• 第2章 HPV16L2重組蛋白疫苗的構(gòu)建15-25
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料15-16
• 2.1.1 質(zhì)粒和菌株15
• 2.1.2 工具酶及主要試劑15
• 2.1.3 主要儀器設(shè)備15-16
• 2.1.4 引物16
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法16-20
• 2.2.1 重組HPV16L2蛋白構(gòu)建16-18
• 2.2.2 重組HPV16L2蛋白表達(dá)18-19
• 2.2.3 重組HPV16L2蛋白純化19-20
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果和討論20-24
• 2.3.1 PCR擴(kuò)增重組HPV16L2基因片段的結(jié)果20
• 2.3.2 重組HPV16L2質(zhì)粒的酶切鑒定和測(cè)序結(jié)果20
• 2.3.3 重組HPV16L2蛋白表達(dá)條件優(yōu)化結(jié)果20-22
• 2.3.4 重組HPV16L2蛋白純化結(jié)果22-24
• 2.4 本章小結(jié)24-25
• 第3章 含HPV16L2h基因的重組腺病毒疫苗的構(gòu)建25-35
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料25-26
• 3.1.1 質(zhì)粒、細(xì)胞和菌株25
• 3.1.2 工具酶及主要試劑25
• 3.1.3 主要儀器設(shè)備25-26
• 3.1.4 引物26
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法26-30
• 3.2.1 重組穿梭質(zhì)粒pDC316的構(gòu)建26-28
• 3.2.2 重組腺病毒的包裝28-29
• 3.2.3 重組腺病毒的鑒定29
• 3.2.4 重組腺病毒疫苗的大量擴(kuò)增和純化29-30
• 3.2.5 重組腺病毒的滴度測(cè)定30
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果和討論30-34
• 3.3.1 PCR擴(kuò)增HPV16L2h基因片段的結(jié)果30
• 3.3.2 重組質(zhì)粒pDC316的酶切鑒定結(jié)果30-31
• 3.3.3 重組腺病毒的HPV16L2h基因和復(fù)制缺陷型的鑒定31-33
• 3.3.4 重組腺病毒表達(dá)HPV16L2h相關(guān)蛋白水平的檢測(cè)33
• 3.3.5 重組腺病毒的滴度測(cè)定結(jié)果33-34
• 3.4 本章小結(jié)34-35
• 第4章 重組蛋白疫苗和重組腺病毒疫苗免疫效果的研究35-47
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料35-36
• 4.1.1 細(xì)胞和疫苗35
• 4.1.2 主要試劑35
• 4.1.3 主要儀器設(shè)備35-36
• 4.1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物36
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法36-40
• 4.2.1 免疫小鼠36-37
• 4.2.2 ELISA和假病毒中和滴定檢測(cè)體液免疫37-38
• 4.2.3 ELISPOT檢測(cè)細(xì)胞免疫反應(yīng)38-40
• 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果和討論40-45
• 4.3.1 體液免疫結(jié)果40-43
• 4.3.2 T細(xì)胞表位肽預(yù)測(cè)結(jié)果43
• 4.3.3 細(xì)胞免疫結(jié)果43-45
• 4.4 本章小結(jié)45-47
• 結(jié)論47-49
• 參考文獻(xiàn)49-53
• 攻讀碩士學(xué)位期間所申請(qǐng)的發(fā)明專利53-55
• 致謝55

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