本文關(guān)鍵詞：乙肝病毒轉(zhuǎn)基因小鼠和多器官障礙綜合征模型的評價及藥物干預(yù)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：乙型肝炎作為一種世界性的傳染病，尚無徹底根治的辦法。乙肝病毒（HBV）的宿主特異性給乙肝疾病模型的建立帶來了很大難度。目前的乙肝動物模型局限性在于所用動物與人類相比在進(jìn)化上相去甚遠(yuǎn)，而一般的哺乳動物又很難感染HBV。因此，建立一種穩(wěn)定可靠的乙肝動物模型對乙肝發(fā)生機(jī)制的研究和抗乙肝藥物的篩選具有重要意義。多器官功能障礙綜合征（MODS）作為一種臨床致死率較高的疾病，其發(fā)病機(jī)制尚無定論，目前普遍認(rèn)為與機(jī)體內(nèi)皮細(xì)胞損傷所釋放的內(nèi)毒素導(dǎo)致多個器官功能障礙有關(guān)。臨床上降低MODS死亡率的手段主要是積極干預(yù)各種會引起感染性休克的因素。而許多抗炎保肝天然產(chǎn)物，能有效抑制機(jī)體炎癥和內(nèi)毒素產(chǎn)生，緩解器官的病理損傷。 本課題第一部分以HBV轉(zhuǎn)基因小鼠作為研究對象，首先驗證轉(zhuǎn)基因小鼠HBV DNA的復(fù)制和HBV抗原的表達(dá)情況，然后在體外細(xì)胞實驗抗乙肝研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，以HBV轉(zhuǎn)基因小鼠作為模型，探討了松果菊苷對HBV復(fù)制的影響。第二部分采用頸動脈穿刺放血和尾靜脈注射脂多糖兩次打擊的方法，建立SD大鼠多器官功能障礙綜合征模型，并運(yùn)用該模型探討了具有抗炎保肝作用的六棱菊提取物（LAE）對實驗性多器官障礙綜合征的改善作用。 一、HBV轉(zhuǎn)基因小鼠病毒表達(dá)特性及松果菊苷抗HBV作用研究 1. HBV轉(zhuǎn)基因小鼠病毒表達(dá)特性研究 HBV轉(zhuǎn)基因小鼠源自正常小鼠受精卵經(jīng)顯微注射整合人類HBV全基因組后培育而成。為了評價轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)HBV的復(fù)制情況，抽提轉(zhuǎn)基因小鼠肝組織和尾巴組織DNA，采用熒光定量PCR方法擴(kuò)增檢測HBV DNA水平，并采用ELISA方法檢測小鼠血清乙肝表面抗原（HBsAg）和E抗原（HBeAg）水平。通過檢測血清轉(zhuǎn)氨酶（GOT/GPT）水平和肝組織病理變化，了解轉(zhuǎn)基因小鼠的肝功能狀況。結(jié)果表明：HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝組織和血清HBV DNA水平在2.0×103~1.0×107copies/ml之間；血清HBsAg和HBeAg呈陽性；轉(zhuǎn)基因小鼠血清GOT和GPT水平明顯高于正常小鼠；肝組織病理學(xué)檢查顯示病理學(xué)檢查顯示局部細(xì)胞形態(tài)和排列出現(xiàn)輕微改變，肝動靜脈有擴(kuò)張趨勢，與轉(zhuǎn)氨酶的升高相吻合。上述結(jié)果表明，HBV轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)HBV的復(fù)制呈活躍狀態(tài)，能夠在一定程度上模擬乙肝患者HBV的復(fù)制，可作為抗乙肝藥物評價的疾病模型。 2.松果菊苷體內(nèi)外抗HBV作用研究 松果菊苷對HepG2.2.15細(xì)胞HBV表達(dá)的影響：以HBV基因轉(zhuǎn)染的HepG2.2.15細(xì)胞為模型，研究松果菊苷的體外抗HBV作用。將HepG2.2.15細(xì)胞接種于96孔板，每孔加入含不同濃度（100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、10μg/ml和1μg/ml）松果菊苷和陽性藥物拉米夫定的DMEM培養(yǎng)基，每種濃度設(shè)三個復(fù)孔。在37℃下培養(yǎng)3和6天后，采用ELISA法測定HBsAg和HBeAg水平；采用熒光定量PCR法測定HBV DNA水平。結(jié)果表明：松果菊苷作用HepG2.2.15細(xì)胞6天后，，在50和100μg/ml濃度下能顯著抑制HBsAg和HBeAg表達(dá)，其最高抑制率分別為42.68%和46.29%；同時對HBV DNA也具有抑制作用。 松果菊苷對HBV轉(zhuǎn)基因小鼠HBV表達(dá)的影響：以HBV轉(zhuǎn)基因小鼠為模型，研究松果菊苷的體內(nèi)抗HBV作用。將40只HBV轉(zhuǎn)基因小鼠隨機(jī)分為5組：對照組、拉米夫定（50mg/kg）組、大劑量松果菊苷（50mg/kg）組、中劑量松果菊苷（25mg/kg）組和小劑量松果菊苷（12.5mg/kg）組。每天灌胃給藥1次，對照組小鼠給予等劑量的生理鹽水，連續(xù)給藥30天。第31天小鼠眼眶取血，分離血清分別檢測HBV DNA、HBsAg、HBeAg、GOT和GPT水平；解剖取其肝臟，提取肝組織DNA并測定其HBV DNA水平，同時制作肝組織病理學(xué)檢查。結(jié)果表明：50mg/kg劑量對血清HBV DNA有顯著抑制作用,但各劑量對肝組織HBV DNA水平均無顯著性影響。 上述結(jié)果表明，松果菊苷具有較明顯的體內(nèi)外抗HBV作用。 二、多器官功能障礙綜合征（MODS）模型的建立及其藥物干預(yù)研究 1. MODS大鼠模型的建立 選取雄性SD大鼠，體重在150-180g之間。動物在建模前12小時開始禁食，以3%的戊巴比妥鈉1ml/kg體重腹腔注射麻醉；用一次性針筒抽取大鼠頸部動脈竇血液2ml，對大鼠造成失血性休克創(chuàng)傷；放血后用生理鹽水3.5ml/kg體重灌胃；再經(jīng)12小時后，尾靜脈注射7ml/kg脂多糖（LPS），造成二次內(nèi)毒素刺激；然后每天用生理鹽水灌胃，連續(xù)三天。三天后從未死亡的造模大鼠中挑選符合多器官障礙體征的大鼠，用于后續(xù)實驗研究。 2.六棱菊提取物（LAE）對MODS的干預(yù)作用研究 取MODS大鼠32只，隨機(jī)分為4組：模型組，LAE大劑量（100mg/kg）組、LAE中劑量（50mg/kg）組和LAE小劑量（25mg/kg）組，試藥組以不同劑量的LAE每天灌胃，模型組給予等劑量的生理鹽水。連續(xù)給藥10天后，采取大鼠血液分離血清，測定超氧化物歧化酶（SOD）、B型鈉尿肽（BNP）、一氧化氮（NO）、肌酸激酶同工酶MB（CK-MB）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、尿素氮（BUN）、白細(xì)胞介素6（IL-6）和內(nèi)毒素含量。結(jié)果顯示LAE對炎癥相關(guān)介質(zhì)具有顯著抑制作用，能有效緩解大鼠體內(nèi)炎癥，減少機(jī)體自由基，顯著改善心功能和肝功能。說明LAE對MODS具有明顯改善作用。 綜上所述，本論文研究了HBV轉(zhuǎn)基因小鼠的病毒表達(dá)特性，并采用HBV轉(zhuǎn)基因小鼠，證明了松果菊苷的抗HBV作用；同時通過建立的MODS大鼠模型，探討了LAE對MODS的改善作用。有關(guān)HBV轉(zhuǎn)基因小鼠和MODS動物模型的研究為今后研制新型乙肝和MODS治療藥物提供了有力的工具。
【關(guān)鍵詞】：乙肝病毒 轉(zhuǎn)基因小鼠 松果菊苷 多器官功能障礙綜合癥 脂多糖 動物模型 六棱菊提取物
【學(xué)位授予單位】：中國計量學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R459.7;R-332
【目錄】：

• 致謝5-6
• 摘要6-9
• Abstract9-19
• 縮略詞表19-20
• 1 緒論20-34
• 1.1 乙型肝炎概述20-22
• 1.1.1 乙肝病毒20-21
• 1.1.2 乙肝病毒的致病機(jī)制21
• 1.1.3 乙肝的流行病學(xué)21-22
• 1.2 抗乙肝藥物概述22-28
• 1.2.1 核苷類藥物22-24
• 1.2.2 細(xì)胞因子類藥物24-25
• 1.2.3 抗乙肝天然產(chǎn)物25-28
• 1.3 抗乙肝藥物評價模型28-31
• 1.3.1 細(xì)胞模型28
• 1.3.2 動物模型28-30
• 1.3.3 HBV 轉(zhuǎn)基因小鼠抗乙肝模型30-31
• 1.4 HBV 轉(zhuǎn)基因小鼠作為抗乙肝模型的運(yùn)用31-32
• 1.4.1 研究慢性乙肝的發(fā)病機(jī)制和探索新的治療手段31-32
• 1.4.2 研究 HBV 感染和 HCC 的關(guān)系32
• 1.4.3 抗乙肝藥物的篩選和療效評價32
• 1.5 多器官功能障礙綜合征(MODS)32-34
• 2 實驗材料34-36
• 2.1 實驗動物34
• 2.2 細(xì)胞株34
• 2.3 實驗藥物34
• 2.4 實驗試劑34-35
• 2.5 實驗主要儀器35-36
• 3 HBV 轉(zhuǎn)基因小鼠病毒表達(dá)特性及松果菊苷抗 HBV 作用研究36-59
• 3.1 HBV 轉(zhuǎn)基因小鼠病毒表達(dá)特性研究36-47
• 3.1.1 實驗方法36-45
• 3.1.2 統(tǒng)計學(xué)處理45
• 3.1.3 實驗結(jié)果45-47
• 3.1.4 討論47
• 3.2 松果菊苷抗乙肝作用研究47-59
• 3.2.1 松果菊苷對 HepG2.2.15 細(xì)胞 HBV 表達(dá)的影響48-53
• 3.2.2 松果菊苷對 HBV 轉(zhuǎn)基因小鼠 HBV 表達(dá)的影響53-57
• 3.2.3 討論57-59
• 4 多器官障礙綜合征模型建立及運(yùn)用59-74
• 4.1 多器官功能障礙綜合征模型(MODS)的建立59
• 4.2 六棱菊提取物(LAE)對 MODS 的干預(yù)作用研究59-72
• 4.2.1 實驗方法59-70
• 4.2.2 實驗結(jié)果70-72
• 4.3 討論72-74
• 5 小結(jié)74-76
• 參考文獻(xiàn)76-81
• 作者簡歷81

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前6條

1 胡新根;訾曉淵;張紅霞;胡以平;;乙肝全基因組轉(zhuǎn)基因小鼠肝組織病理及部分免疫學(xué)特征[J];武漢大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2012年04期

2 楊文萍,李鈞敏,王錦文;血清一氧化氮含量測定方法的比較[J];江西醫(yī)學(xué)檢驗;2002年03期

3 陳迪;田楓;康愛君;王學(xué)文;鄭振輝;;C57BL/6J-HBV轉(zhuǎn)基因小鼠隨增齡乙肝表面抗原表達(dá)及轉(zhuǎn)氨酶水平變化探討[J];四川動物;2011年02期

4 季波,趙樹進(jìn);SOD檢測與疾病關(guān)系的國內(nèi)研究概況[J];廣東藥學(xué);2002年01期

5 趙麗紅;任玉新;;抗乙肝病毒藥物的研究進(jìn)展[J];醫(yī)學(xué)理論與實踐;2008年10期

6 張霞;程富勝;;GPA對小鼠肝損傷血清及肝組織中GOT、GPT的影響[J];中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志;2011年04期

  本文關(guān)鍵詞：乙肝病毒轉(zhuǎn)基因小鼠和多器官障礙綜合征模型的評價及藥物干預(yù)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：450838