發(fā)布時間：2017-06-12 10:01

  本文關(guān)鍵詞：Hfq對霍亂弧菌環(huán)境適應(yīng)能力的影響及相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的構(gòu)建霍亂弧菌C7258菌株的hfq基因的缺失株和缺失回補(bǔ)株,分析Hfq蛋白對霍亂弧菌環(huán)境適應(yīng)能力的影響,驗(yàn)證Hfq對環(huán)境生存及致病相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控。 方法1.PCR方法擴(kuò)增霍亂弧菌C7258菌株hfq基因的上、下游片段,作為上和下游同源臂,搭橋PCR方法擴(kuò)增將上、下游同源臂連接。搭橋PCR片段和自殺質(zhì)粒pWM91分別進(jìn)行雙酶切,之后用連接酶進(jìn)行連接,獲得重組自殺質(zhì)粒△hfq-pMW91,轉(zhuǎn)化入大腸桿菌SM10λpir株。采用同源重組方法,通過結(jié)合將自殺質(zhì)粒△hfq-pMW91轉(zhuǎn)入霍亂弧菌C7258菌株,利用慶大霉素和氨芐青霉素雙抗平板和口pWM91質(zhì)粒的sacB基因在蔗糖平板上殺死供體菌的方法構(gòu)建霍亂弧菌C7258菌株的hfq基因的缺失株,并進(jìn)行PCR鑒定。2.PCR方法擴(kuò)增hfq基因,獲得完整的基因片段△fhq-C,將△fhq-C片段和(?)pUC18克隆載體分別進(jìn)行XbaI和HidⅢ限制性內(nèi)切酶雙酶切,連接酶連接2酶切產(chǎn)物,轉(zhuǎn)化入大腸桿菌SM10λpir菌株中,獲得重組克隆載體△hfq-C-pUC18。將△hfq-C-pUC18重組克隆載體電轉(zhuǎn)入△hfq缺失株中,獲得△hfq-C回補(bǔ)株,篩選陽性克隆病用PCR鑒定。3.PCR方法擴(kuò)增hfq基因,獲得hfq-P片段,限制性內(nèi)切酶BamHI和HIDⅢ分別雙酶切hfq-P片段和表達(dá)載體pET28a,將酶切產(chǎn)物連接,轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中,獲得Hfq蛋白表達(dá)株hfq-P-BL21(DE3),經(jīng)IPTG誘導(dǎo),進(jìn)行12%SDS-PAGE蛋白電泳。4.通過對野生株、突變株、回補(bǔ)株在富氧、缺氧、膽鹽、M9環(huán)境下的生長狀態(tài),從初始培養(yǎng)到平臺期整個過程,每隔1小時測定D600mm,重復(fù)三次,用平均值繪成生長曲線,統(tǒng)計學(xué)方法比較差異；將野生株、突變株、回補(bǔ)株點(diǎn)在Swim平板上,30℃培養(yǎng)24小時,觀察細(xì)菌的游動能力,光學(xué)顯微鏡觀察野生株、突變株、回補(bǔ)株菌落的透明度及褶皺程度,對野生株、突變株、回補(bǔ)株培養(yǎng)24小時進(jìn)行結(jié)晶紫染色,并測定D570nm；野生株和突變株對不同濃度的去污劑SDS及慶大霉素的抗性能力比較及應(yīng)對H2O2刺激的敏感性測定,從而比較霍亂弧菌野生株和Hfq突變株在營養(yǎng)受限條件下細(xì)菌的生長狀況,細(xì)菌的運(yùn)動能力、生物膜形成、外膜抗性和氧化應(yīng)激能力上的差異。5.針對霍亂弧菌△hfq缺失株表型實(shí)驗(yàn)結(jié)果,推測可能的相關(guān)調(diào)控基因,并提取霍亂弧菌野生株和缺失株的RNA,應(yīng)用熒光定量PCR(RT-qPCR)技術(shù)對Hfq可能調(diào)控的相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行比較,靶基因涉及鞭毛合成,胞外多糖合成,外膜蛋白,整體調(diào)控子以及氧化應(yīng)激相關(guān)。 結(jié)果1.通過基因敲除-同源重組技術(shù)成功構(gòu)建了霍亂弧菌C7258菌株的△hfq缺株。2.通過融合PCR技術(shù)和電轉(zhuǎn)化技術(shù)成功構(gòu)建了霍亂弧菌△hfq缺失株的△hfq-C/△hfq回補(bǔ)株。3.通過融合PCR技術(shù)和鈣轉(zhuǎn)化技術(shù)成功構(gòu)建了大腸桿菌hfq-P-BL21(DE3)-DH5αλpir蛋白表達(dá)株。4.Hfq蛋白激活與鞭毛合成及功能相關(guān)基因fliA,flaA,flaC,motA,motX轉(zhuǎn)錄從而增強(qiáng)霍亂弧菌的游動能力；但Hfq蛋白不調(diào)控galU和galE的轉(zhuǎn)錄,提示Hfq蛋白不影響霍亂弧菌的脂多糖結(jié)構(gòu)；Hfq蛋白抑制胞外多糖的合成基因vpsT和vpsA轉(zhuǎn)錄,同時抑制VPS合成的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子vpsR轉(zhuǎn)錄,達(dá)到抑制生物膜形成的作用。5.Hfq蛋白激活外膜蛋白OmpU和OmpT轉(zhuǎn)錄,起到提高外膜抗性能力。6.Hfq蛋白抑制katE和sodC的轉(zhuǎn)錄,激活ohoB和katG的轉(zhuǎn)錄,相對作用的最終結(jié)果是Hfq蛋白提高抵御氧化應(yīng)激的能力。7.Hfq蛋白作為sRNA伴侶分子可能與phoB,HapR,ToxR等調(diào)控子一起,協(xié)同控制上述基因的表達(dá),從而使霍亂弧菌感知外界環(huán)境變化以抵御不利環(huán)境而生存下去。 結(jié)論Hfq蛋白作為RNA伴侶分子,能夠通過調(diào)控一些生存及致病相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)而影響霍亂弧菌的游動性、生物膜形成、氧化應(yīng)激反應(yīng)、抗生素抗性等能力,表明Hfq可能與其它調(diào)控子一起,在霍亂弧菌的生存、代謝以及致病因子轉(zhuǎn)錄的協(xié)調(diào)控制上起著關(guān)鍵性的作用。
【關(guān)鍵詞】：霍亂弧菌 Hfq 同源重組 環(huán)境適應(yīng) 轉(zhuǎn)錄調(diào)控
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R378.3;R3411
【目錄】：

• 摘要2-4
• Abstract4-8
• 引言8-9
• 1 材料9-11
• 1.1 菌株和質(zhì)粒9
• 1.2 培養(yǎng)基9-10
• 1.3 主要試劑10
• 1.4 主要儀器10-11
• 2 方法11-34
• 2.1 霍亂弧菌△hfq突變株的構(gòu)建11-18
• 2.2 霍亂弧菌△hfq-C回補(bǔ)株的構(gòu)建18-22
• 2.3 霍亂弧菌C7258菌株霍亂弧菌Hfq蛋白的表達(dá)22-26
• 2.4 霍亂弧菌△hfq突變株相關(guān)表型實(shí)驗(yàn)26-30
• 2.4.1 不同氧氣條件下Hfq對霍亂弧菌生長的影響26
• 2.4.2 不同營養(yǎng)條件下Hfq對霍亂弧菌生長的影響26-27
• 2.4.3 野生株、突變株和回補(bǔ)株的游動性27-28
• 2.4.4 野生株、突變株和回補(bǔ)株的菌落透明度及褶皺程度28
• 2.4.5 野生株、突變株和回補(bǔ)株的結(jié)晶紫染色28-29
• 2.4.6 野生株和突變株對SDS和慶大霉素的耐受29
• 2.4.7 野生株和突變株對霍亂弧菌H_2O_2抗性的影響29-30
• 2.5 Hfq可能調(diào)控的相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄分析30-34
• 2.5.1 霍亂弧菌野生株和△hfq突變株RNA的提取及cDNA的合成30-31
• 2.5.2 qPCR 驗(yàn)證31-34
• 3 結(jié)果34-43
• 3.1 霍亂弧菌突變株△hfq缺失株的構(gòu)建34-35
• 3.2 霍亂弧菌突變株△hfq-C回補(bǔ)株的構(gòu)建35-36
• 3.3 霍亂弧菌hfq~P蛋白表達(dá)株的構(gòu)建36
• 3.4 His-Hfq蛋白表達(dá)鑒定36-37
• 3.5 霍亂弧菌△hfq突變株表型實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)分析37-41
• 3.5.1 不同氧氣條件下Hfq對霍亂弧菌生長的影響37
• 3.5.2 不同營養(yǎng)條件下Hfq對霍亂弧菌生長的影響37-38
• 3.5.3 Hfq對霍亂弧菌生物膜形成能力的影響38-40
• 3.5.4 Hfq對霍亂弧菌SDS和慶大霉素耐受的影響40-41
• 3.5.5 Hfq對霍亂弧菌H2O2抗性的影響41
• 3.6 Hfq可能調(diào)控相關(guān)基因的qPCR驗(yàn)證41-43
• 4 討論43-49
• 5 結(jié)論49-50
• 參考文獻(xiàn)50-51
• 綜述：霍亂弧菌生物膜的形成及調(diào)控機(jī)制51-64
• 參考文獻(xiàn)59-64
• 攻讀學(xué)位期間成果64-65
• 致謝65-66

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 劉霞;高鶴;楊琳;張義全;譚亞芳;郭兆彪;黃新祥;楊瑞馥;周冬生;;副溶血性弧菌基因敲除方法的建立及應(yīng)用[J];中國實(shí)驗(yàn)動物學(xué)報;2011年03期

  本文關(guān)鍵詞：Hfq對霍亂弧菌環(huán)境適應(yīng)能力的影響及相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：443761