發(fā)布時(shí)間：2017-06-03 11:06

  本文關(guān)鍵詞：家兔外周血間充質(zhì)干細(xì)胞的富集及生物學(xué)特性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：建立從動(dòng)員后家兔外周血分離、擴(kuò)增外周血間充質(zhì)干細(xì)胞(PBMSCs)的方法,并就家兔PBMSCs表型特征、集落形成率及體外多向分化能力等生物學(xué)特性進(jìn)行研究評(píng)價(jià),以確證家兔存在PBMSCs,并為外周血作為間充質(zhì)干細(xì)胞的新來(lái)源提供有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：①家兔PBMSCs的分離及表型鑒定：取成年新西蘭大白兔,按照30μg/kg給藥劑量皮下注射G-CSF動(dòng)員6天,取兔外周血20ml,采用密度梯度離心法和貼壁培養(yǎng)法分離、培養(yǎng)兔PBMSCs;取培養(yǎng)的P2代細(xì)胞,用流式細(xì)胞術(shù)(CD29、CD14)、免疫細(xì)胞化學(xué)染色(CD90、CD105、CD44、CD34、CD45)對(duì)分離培養(yǎng)的兔PBMSCs進(jìn)行表型鑒定,實(shí)驗(yàn)同時(shí)采用聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)對(duì)維持干細(xì)胞多能性轉(zhuǎn)錄因子OCT4的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。②家兔PBMSCs生長(zhǎng)曲線、細(xì)胞倍增時(shí)間(DT)及集落形成率(CFE)分析：取P2代細(xì)胞,以5×103/孔接種于24孔板,37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng),從接種第2d起每日消化3孔細(xì)胞,采用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù),連續(xù)7d,繪制生長(zhǎng)曲線,并計(jì)算細(xì)胞倍增時(shí)間。兔PBMSCs集落形成率的檢測(cè)：分別取未動(dòng)員及動(dòng)員后的兔外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMNCs),按5×105/cm2接種于6孔板中,用含15%FBS、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的a-MEM培養(yǎng)基,置37℃、5%CO2飽和濕度條件下進(jìn)行培養(yǎng),14d后4%多聚甲醛固定,結(jié)晶紫染色,置解剖鏡下觀察,對(duì)細(xì)胞數(shù)目超過50個(gè)的集落進(jìn)行計(jì)數(shù)。集落形成率=集落形成單位數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)(×106)。③家兔PBMSCs向中胚層細(xì)胞分化能力鑒定：包括成骨、成軟骨和成脂分化能力。成骨誘導(dǎo)分化鑒定：取P2代細(xì)胞,以3.0×103/cm2密度接種于預(yù)置蓋玻片的6孔板內(nèi),待細(xì)胞生長(zhǎng)匯合度達(dá)50%～60%時(shí),棄去原培養(yǎng)基,誘導(dǎo)組細(xì)胞換成2ml/孔誘導(dǎo)培養(yǎng)液(含10%FBS、雙抗、谷氨酰胺、抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉、地塞米松)。置37℃、5%CO2飽和濕度下培養(yǎng),每3d換液1次,倒置顯微鏡觀察形態(tài)變化,于誘導(dǎo)第21d進(jìn)行茜素紅染色鑒定成骨誘導(dǎo)分化情況。成軟骨分化能力鑒定：取P2代細(xì)胞,按5×105/mL細(xì)胞密度加入軟骨誘導(dǎo)完全培養(yǎng)基(含VitC、ITS添加物、地塞米松、丙酮酸鈉、脯氨酸、TGF-β3)重懸細(xì)胞,吸取500μL細(xì)胞懸液(2.5×105個(gè)細(xì)胞)轉(zhuǎn)入15mL離心管中,150g離心5min,離心后小心地將離心管蓋擰松,置37℃、5%C02飽和濕度下培養(yǎng)。每3d換液一次,觀察細(xì)胞團(tuán)塊變化,并于誘導(dǎo)21d后進(jìn)行培養(yǎng)細(xì)胞團(tuán)塊的石蠟包埋、切片,脫蠟后進(jìn)行阿利新藍(lán)染色。成脂細(xì)胞分化能力鑒定：取P2代細(xì)胞,以2×104/cm2密度接種于預(yù)置蓋玻片的6孔板中,待細(xì)胞長(zhǎng)滿孔底時(shí)(培養(yǎng)2d左右),棄去原培養(yǎng)基,誘導(dǎo)組換成2mL/孔誘導(dǎo)培養(yǎng)液A(含10%FBS、雙抗、谷氨酰胺、胰島素、IBMX、吲哚美辛、地塞米松)培養(yǎng)3d,再換成維持培養(yǎng)液B(含10%FBS、雙抗、谷氨酰胺、胰島素)培養(yǎng)1d,構(gòu)成一個(gè)培養(yǎng)循環(huán),同法培養(yǎng)三個(gè)循環(huán)后,用維持培養(yǎng)基B繼續(xù)培養(yǎng)7天,于誘導(dǎo)結(jié)束后取出標(biāo)本進(jìn)行油紅染色。④家兔PBMSCs的跨胚層分化能力鑒定：包括神經(jīng)元樣細(xì)胞、肝樣細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)鑒定。含10%FBS、1pmol/L全反式維甲酸(ATRA)、2mmol/L L-Glu的a-MEM培養(yǎng)基用于神經(jīng)元細(xì)胞誘導(dǎo)分化；采用添加表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、堿性成纖維生長(zhǎng)因子(bFGF)預(yù)誘導(dǎo)2d后,再采用添加HGF、bFGF和尼克酰胺培養(yǎng)基誘導(dǎo)9d,最后用添加抑瘤素M、地塞米松和ITS液培養(yǎng)基誘導(dǎo)10d的分步誘導(dǎo)法誘導(dǎo)肝樣細(xì)胞分化。采用免疫組化染色檢測(cè)神經(jīng)元誘導(dǎo)培養(yǎng)后的神經(jīng)元核蛋白(NeuN)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)的表達(dá)；免疫細(xì)胞化學(xué)染色法對(duì)肝樣細(xì)胞分化后的CK18的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)分析。 結(jié)果：①家兔PBMSCs培養(yǎng)形態(tài)：原代培養(yǎng)24h后,可見較多短梭形及多角形貼壁細(xì)胞,3-4d后出現(xiàn)集落樣生長(zhǎng),接種9-10d融合度達(dá)80%以上；傳代培養(yǎng)的PBMSCs形態(tài)均一、呈長(zhǎng)梭形漩渦狀生長(zhǎng)。②家兔PBMSCs表型特征：FCM分析結(jié)果顯示PBMSCs表達(dá)CD29,不表達(dá)CD14；免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示,PBMSCs表達(dá)CD105、D44、CD90及波形蛋白,不表達(dá)CD34和CD45。RT-PCR結(jié)果表明,PBMSCs表達(dá)多潛能干細(xì)胞特定轉(zhuǎn)錄因子OCT-4。③家兔PBMSCs生長(zhǎng)曲線、細(xì)胞倍增時(shí)間及集落形成率：生長(zhǎng)曲線顯示PBMSCs增殖能力旺盛,培養(yǎng)后2d進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,細(xì)胞倍增時(shí)間為37.4h；經(jīng)CFU-F集落形成率的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,動(dòng)員后的家兔PBMSCs存在頻率為每百萬(wàn)個(gè)外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMNCs)中有2.8～10.8個(gè)PBMSCs,而未動(dòng)員組僅為0～3個(gè)/106。④家兔PBMSCs的成骨、成軟骨和成脂分化能力：PBMSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)21d后,茜素紅染色顯示有明顯的鈣結(jié)節(jié)形成；經(jīng)軟骨培養(yǎng)體系誘導(dǎo)后21d的細(xì)胞團(tuán)切片,阿利新藍(lán)染色呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)；經(jīng)成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)21d后,油紅染色顯示誘導(dǎo)細(xì)胞胞漿內(nèi)有大量脂滴。⑤家兔PBMSCs的跨胚層分化(神經(jīng)元樣細(xì)胞、肝樣細(xì)胞)能力：PBMSCs經(jīng)神經(jīng)元培養(yǎng)體系誘導(dǎo)后,出現(xiàn)NSE、NeuN表達(dá)；經(jīng)肝樣細(xì)胞培養(yǎng)體系誘導(dǎo)后可表達(dá)CK18。未誘導(dǎo)組均不表達(dá)上述分子。 結(jié)論：成功從動(dòng)員后家兔外周血中分離培養(yǎng)出高增殖能力的MSCs,即PBMSCs。在適宜的誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下,家兔PBMSCs可向中胚層細(xì)胞(成骨、成軟骨、成脂細(xì)胞)分化；同時(shí),本實(shí)驗(yàn)還證實(shí)了分離培養(yǎng)的家兔PBMSCs具有向內(nèi)胚層(肝樣細(xì)胞)和外胚層(神經(jīng)元樣細(xì)胞)細(xì)胞跨系分化的潛力,提示外周血可以做為MSCs的新來(lái)源,PBMSCs有望成為治療各種慢性組織損傷性疾病研究的新的供體細(xì)胞。
【關(guān)鍵詞】：外周血 間充質(zhì)干細(xì)胞 誘導(dǎo)分化 成骨細(xì)胞 成軟骨細(xì)胞 成脂細(xì)胞 神經(jīng)元樣細(xì)胞 肝樣細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R329.2
【目錄】：

• 英文~.略詞3-6
• 摘要6-9
• ABSTRACT9-13
• 前言13-15
• 材料與方法15-25
• 結(jié)果25-36
• 討論36-40
• 結(jié)論40-41
• 參考文獻(xiàn)41-46
• 綜述46-54
• 參考文獻(xiàn)51-54
• 致謝54-55
• 作者簡(jiǎn)介55

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前8條

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  本文關(guān)鍵詞：家兔外周血間充質(zhì)干細(xì)胞的富集及生物學(xué)特性研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：417966