發(fā)布時(shí)間：2017-06-02 23:06

  本文關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因表達(dá)乙型肝炎病毒抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞受體的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是一種嚴(yán)重危害人體健康的常見疾病,呈世界流行趨勢(shì)。據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道,全球約20億人曾感染過HBV,其中3.5億人為慢性HBV感染者,每年約有100萬人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原發(fā)性肝細(xì)胞癌。慢性乙型肝炎是肝硬化和肝癌的危險(xiǎn)因素。缺少十分有效的清除病毒手段一直是困擾慢性乙肝治療的難題。HBV感染的致病機(jī)制復(fù)雜,現(xiàn)一般認(rèn)為是一系列宿主免疫反應(yīng)造成肝細(xì)胞內(nèi)的病理性免疫損害,引起各種臨床表現(xiàn)。而其中主要的免疫效應(yīng)細(xì)胞則是HBV抗原特異性T細(xì)胞特別是細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocytes, CTL), HBV特異性CTL對(duì)清除肝細(xì)胞內(nèi)感染的HBV起著關(guān)鍵作用。在急性乙型肝炎患者體內(nèi),HBV很快能被清除的重要原因是因?yàn)榇嬖谳^強(qiáng)的多克隆CTL反應(yīng),而慢性乙型肝炎患者體內(nèi)CTL反應(yīng)很弱或針對(duì)的病毒抗原表位單一,導(dǎo)致不能完全清除HBV。引起這種HBV特異性CTL反應(yīng)差異的分子機(jī)制目前尚未完全闡明。CTL是CD8+T細(xì)胞,其特異性由T細(xì)胞受體(T cell receptor, TCR)決定,參與特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答的CD8T細(xì)胞主要是TCR αβT細(xì)胞,其多樣性和特異性產(chǎn)生于TCR分子α和p鏈基因的VDJ重排。因此,揭示特異性CTL的TCR分子的組成特點(diǎn)對(duì)深入理解HBV免疫應(yīng)答反應(yīng)機(jī)制十分重要。 本研究的目標(biāo)是通過獲取HBV抗原特異性CTL,分析CTL上的TCR分子特性,轉(zhuǎn)基因表達(dá)特異性CTL TCR,使非特異性T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)镠BV抗原特異性CTL,獲得抗病毒活性,從而有助于深入闡明HBV免疫應(yīng)答反應(yīng)機(jī)制,并將為進(jìn)一步在機(jī)體水平(例如HBV/HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi))評(píng)價(jià)HBV特異性CTL的作用和機(jī)制建立基礎(chǔ),最終為臨床發(fā)展和完善以HBV抗原特異性CTL為基礎(chǔ)的免疫療法治療慢性乙肝提供重要幫助。 目的：克隆HBV抗原特異性CTL TCR編碼基因,通過逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)HBV抗原特異性CTL的TCR轉(zhuǎn)基因表達(dá),初步觀察其結(jié)合活性。 方法： 1.采集具有特異性CTL反應(yīng)的HLA-A2限制性急性乙肝患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC),通過體外表位(WLSLLVPFV, Env335-343)多肽和細(xì)胞因子的誘導(dǎo)富集特異性CTL后,用流式細(xì)胞儀分選法(CD3+CD8+Pentamer+)純化特異性CTL；對(duì)純化的CTL進(jìn)行克隆化培養(yǎng),用抗CD3/CD28抗體在加入經(jīng)照射的EBV轉(zhuǎn)化B細(xì)胞滋養(yǎng)體系中擴(kuò)增CTL。 2.提取擴(kuò)增后CTL的細(xì)胞RNA；設(shè)計(jì)簡并引物進(jìn)行RT-PCR并結(jié)合5’末端快速擴(kuò)增技術(shù)(rapid amplification of cDNA ends, RACE)、3'RACE等方法擴(kuò)增獲取編碼特異性TCR的α和β鏈基因；分析一定數(shù)量的克隆序列,確定具有優(yōu)勢(shì)亞型的α和β鏈基因作為研究的目標(biāo)基因。 3.構(gòu)建TCR編碼基因重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,用內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)連接α和β鏈基因；轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞,獲取重組假病毒；對(duì)重組假病毒進(jìn)行鑒定。 4.用重組假病毒分別轉(zhuǎn)導(dǎo)Jurkat T細(xì)胞和人HLA-A2+的PBMC,針對(duì)PBMC,用IL-2和抗CD3抗體刺激細(xì)胞分裂增殖以提高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率；用Pentamer、抗CD8、抗CD3和抗Vp13熒光抗體(anti-Vβ13TCR-PE)染色,流式細(xì)胞儀分析鑒定細(xì)胞表面特異性TCR表達(dá)水平。 結(jié)果： 1.對(duì)6例急性乙肝患者樣本600多個(gè)TCRα鏈和β鏈克隆基因序列分析的結(jié)果提示,HBV特異性CTL均呈現(xiàn)TCR分子α鏈、β鏈基因家族優(yōu)勢(shì)表達(dá)特點(diǎn),每例患者樣本以2-4種α鏈和1～4種β鏈家族為主,其中α2、α14、α15、β3、β13和p23家族同時(shí)出現(xiàn)在1例以上患者,有1例患者所有克隆分析的β鏈基因均為β13家族。同一患者同一家族α、β鏈CDR3區(qū)序列趨于一致,而不同患者同一家族α、p鏈CDR3區(qū)序列相差較大。 2.從1例HLA-A2+急性乙肝患者樣本中分別獲得了2組TCR Vα、Vp配對(duì)全長基因序列,分別命名為α21β13、α15β13。 3.經(jīng)過鑒定,TCR編碼基因α15β13、α21β13已分別連入特異性逆轉(zhuǎn)錄病毒SAMEN載體,分別構(gòu)建成重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體SAMEN-α15-β13和SAMEN-α21-β13。將其轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞后獲得的包裝重組病毒達(dá)到1.5×105～5.0×105IU/ml, 4.用針對(duì)目標(biāo)TCR的特異性抗Vp鏈抗體anti-Vβ13TCR-PE和HLA-A2限制性表位特異性五聚體(pentamer)進(jìn)行熒光染色,重組TCR在T細(xì)胞表面獲得表達(dá)：其中在Jurkat細(xì)胞上轉(zhuǎn)入的Vβ13鏈表達(dá)細(xì)胞占1.06%-2.25%,在HLA-A2陽性健康人T細(xì)胞上Vβ13陽性細(xì)胞和pentamer陽性細(xì)胞分別占到1.03%-2.06%和1.05%-1.12%,在HLA-A2陰性健康人T細(xì)胞上Vβ13陽性細(xì)胞和pentamer陽性細(xì)胞均低于0.05%。 結(jié)論： 1.經(jīng)HBV抗原表位多肽誘導(dǎo)增殖的特異性CTL具有明顯的TCRα、β鏈取用優(yōu)勢(shì)特點(diǎn),這種TCR鏈的優(yōu)勢(shì)表達(dá)特點(diǎn)可能是影響抗HBV感染特異性細(xì)胞免疫力的重要分子基礎(chǔ)。 2.通過表位多肽誘導(dǎo)后,用流式細(xì)胞分選少量特異性CTL,再進(jìn)行優(yōu)勢(shì)CTL克隆擴(kuò)增,可以獲得配對(duì)正確的CTL TCRα/β鏈基因,避免建立CTL穩(wěn)定細(xì)胞系的困難。 3.首次獲得了HLA-A2限制性Env335-343表位特異性CTL TCR的編碼基因,通過逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)獲得HBV特異性TCR轉(zhuǎn)基因表達(dá),使非特異性T細(xì)胞獲得了結(jié)合Env335-343表位的活性。
【關(guān)鍵詞】：乙型肝炎病毒 細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞 T細(xì)胞受體 表位特異性 表達(dá)
【學(xué)位授予單位】：桂林醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R373.2
【目錄】：

• 目錄3-5
• 中文摘要5-9
• ABSTRACT9-14
• 英漢縮略詞對(duì)照表14-17
• 前言17-20
• 1 材料與方法20-44
• 1.1 研究對(duì)象20-21
• 1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑21-22
• 1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器22
• 1.4 HLA-A2分型和亞型的鑒定22-23
• 1.5 HBV特異性CD8 T細(xì)胞的獲得23-25
• 1.6 提取優(yōu)勢(shì)CTL細(xì)胞RNA及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)25-27
• 1.7 5'RACE獲取TCR基因雙鏈及分析27-29
• 1.8 3'RACE獲取TCR p鏈恒定區(qū)基因29-30
• 1.9 回收和克隆5'RACE和3'RACE產(chǎn)物30-32
• 1.10 OVERLAP PCR制備全長α鏈β鏈全長基因32-33
• 1.11 TCR分子表達(dá)載體構(gòu)建33-37
• 1.12 重組載體轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞獲取TCR基因重組逆轉(zhuǎn)錄病毒37-41
• 1.13 重組病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)TCR表達(dá)41-44
• 2 結(jié)果44-52
• 2.1 TCRα鏈β鏈的獲得44-48
• 2.2 重組TCR分子的構(gòu)建48-49
• 2.3 TCRα/β鏈基因重組逆轉(zhuǎn)病毒的包裝49-50
• 2.4 重組TCR在細(xì)胞表面的轉(zhuǎn)導(dǎo)表達(dá)與鑒定50-52
• 3 討論52-56
• 4 結(jié)論56-57
• 參考文獻(xiàn)57-63
• 綜述63-74
• 參考文獻(xiàn)69-74
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的核心期刊學(xué)術(shù)論文與國際會(huì)議論文目錄74
• 攻讀學(xué)位期間參與申報(bào)的國家發(fā)明專利74-75
• 致謝75

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前8條

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2 何長倫;王壽明;鄭紀(jì)山;張益紅;唐雨德;;慢性乙型肝炎病毒感染者HBcAg特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞克隆的建立[J];實(shí)用肝臟病雜志;2010年02期

3 李曉東;徐東平;成軍;鐘彥偉;劉妍;董菁;王琳;張玲霞;;中國人群流行的乙型肝炎病毒特異性CTL表位特點(diǎn)分析[J];解放軍醫(yī)學(xué)雜志;2006年08期

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6 葉海燕;王琳;丁寧;范振平;劉妍;鐘彥偉;劉永明;徐東平;;急性乙型肝炎患者HBV特異性CD8~+ T細(xì)胞受體α和β鏈亞家族特點(diǎn)[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2010年09期

7 徐東平,王福生,張玲霞;特異性CTL在乙型肝炎病毒感染中作用的研究[J];中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志;2003年04期

8 范振平,王福生,徐東平,褚福亮,施明,周宇,張玲霞;乙型肝炎患者HBcAg特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的檢測及其與臨床疾病狀態(tài)的關(guān)系[J];中華醫(yī)學(xué)雜志;2004年24期

  本文關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因表達(dá)乙型肝炎病毒抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞受體的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：416720