本文關(guān)鍵詞：MCSP特異性單克隆抗體的研制及其性質(zhì)和功能的初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：1研究目的與意義 乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤,20世紀(jì)以來乳腺癌的發(fā)病率在世界各地均有上升的趨勢，在歐洲、北美占女性惡性腫瘤發(fā)病的第一、二位。中國在九十年代初有乳腺癌患者20萬，每年新發(fā)病約5萬例。三陰性乳腺癌（triple negativebreast cancer，TNBC）即雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）、人表皮生長因子受體2（human epidermal growthfactor receptor2，HER2）均表達(dá)為陰性，，此型占所有乳腺癌患者的大約20%-25%，惡性程度高、侵襲性強(qiáng)，目前沒有標(biāo)準(zhǔn)治療方案，雖對化療敏感，但易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，也易產(chǎn)生耐藥性，5年生存率不足15%。 癌細(xì)胞來源于正常細(xì)胞，與正常細(xì)胞的差別很小，但有些蛋白是是癌細(xì)胞所特有的，而正常細(xì)胞缺乏或表達(dá)低而不易找到。本實(shí)驗(yàn)研究的MCSP（melanoma-associated chondroitin sulfate proteoglycan，人黑色素瘤相關(guān)硫酸軟骨素蛋白聚糖），又稱CSPG4（chondroitin sulfate proteoglycan4，硫酸軟骨素蛋白聚糖4)或HMW-MAA（high molecular weight-melanoma associated antigen，高分子量黑色素瘤相關(guān)抗原）是人黑色素瘤細(xì)胞表面表達(dá)的黑色素瘤相關(guān)抗原，在正常組織細(xì)胞表達(dá)很少或缺乏，而在80%以上的黑色素瘤表達(dá)；MCSP在進(jìn)化上很保守，由N端連結(jié)的280KD的糖蛋白和450KD的硫酸軟骨素蛋白多糖組成，具有較強(qiáng)的免疫原性，早已成為惡性黑色素瘤免疫治療的重要靶位。新近研究表明：MCSP在一些人乳腺癌特別是三陰性乳腺癌（TNBC）細(xì)胞表面表達(dá)，是一種潛在的TNBC標(biāo)志物和“靶位”；MCSP特異性抗體在小鼠實(shí)驗(yàn)中顯示出良好的抗三陰性乳腺癌轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)作用，然而MCSP在人乳腺癌中相關(guān)研究報(bào)道很少，據(jù)文獻(xiàn)檢索，國內(nèi)目前未見MCSP特異性抗體的研究報(bào)道。 本項(xiàng)目以純化的MCSP為免疫原，采用傳統(tǒng)的小鼠雜交瘤技術(shù)，建立抗原包被的ELISA法和Cell-ELISA法，以此方法篩選與MCSP和MCSP表達(dá)陽性的人黑色素瘤細(xì)胞特異性結(jié)合的小鼠單克隆抗體；采用辛酸-硫酸銨沉淀法、ProteinG柱層析法分離純化MCSP特異性的小鼠腹水抗體；采用秋水仙素阻斷法、SDS-PAGE等對抗體進(jìn)行理化等特性鑒定；采用抗原抑制試驗(yàn)、流式細(xì)胞技術(shù)、免疫熒光染色法對抗體的免疫學(xué)結(jié)合特性進(jìn)行鑒定；采用RT-PCR法檢測MCSP在人乳腺癌細(xì)胞株中表達(dá)，并采用流式細(xì)胞技術(shù)初步研究了MCSP特異性抗體與人乳腺癌細(xì)胞株的結(jié)合情況。本論文課題研究主要目的為MCSP在乳腺癌中表達(dá)、生物學(xué)功能研究以及為以MCSP為靶點(diǎn)的抗乳腺癌靶向治療研究提供抗體工具。 2研究的主要內(nèi)容、方法和結(jié)果 （1）MCSP免疫原的鑒定：純化的MCSP由Robert C. Spiro博士提供，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳的檢測，證明了此樣品具有很好的純度。用此樣品作為免疫原免疫小鼠。 （2）MCSP免疫BALB/C小鼠：采用GM-CSF質(zhì)粒肌肉注射MCSP+與saponin（皂素）混合物的腹腔注射。該免疫方法是成功的：抗原包被ELISA法測定免疫血清效價(jià)為1:6400；Cell-ELISA法測定免疫血清效價(jià)為1:1600。 （3）雜交瘤細(xì)胞株篩選方法建立：MCSP抗原包被ELISA法初步篩選出與能分泌MCSP特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞株；再采用Cell-ELISA（人黑色素瘤細(xì)胞株MV3和1520分別為MCSP表達(dá)陽性細(xì)胞株和陰性細(xì)胞株）法篩選能分泌與人黑色素瘤細(xì)胞株表面MCSP結(jié)合的抗體的雜交瘤細(xì)胞。該兩種方法均顯示：陽性對照抗體mAb225.28結(jié)合陽性，陰性對照抗體MK2-23結(jié)合陰性，證明篩選方法可行。 （4）細(xì)胞融合及篩選：細(xì)胞融合采用傳統(tǒng)小鼠雜交瘤技術(shù)。用MCSP免疫的小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞Ag8.653在PEG介導(dǎo)下融合，經(jīng)過MCSP包被的ELISA篩選,獲得與MCSP結(jié)合較強(qiáng)陽性的21孔雜交瘤細(xì)胞；采用Cell-ELISA進(jìn)一步篩選21孔雜交瘤細(xì)胞上清抗體，其中P1C6、P2G2、P4E4和P5F5四個(gè)孔細(xì)胞上清與MV3細(xì)胞結(jié)合反應(yīng)陽性，與1520細(xì)胞結(jié)合反應(yīng)陰性，其中P4E4孔的上清陽性反應(yīng)最強(qiáng)，保留這四孔細(xì)胞進(jìn)行克�。粚�4E4孔雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)大，用有限稀釋法進(jìn)行克隆化處理，采用Cell-ELISA法檢測克隆孔細(xì)胞上清抗體，細(xì)胞克隆陽性率可為100%；取與黑色素瘤細(xì)胞MV3結(jié)合陽性反應(yīng)最強(qiáng)的孔P1D2細(xì)胞，其產(chǎn)生的抗體命名為CSPG4-0711。將此孔細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，凍存，并用于產(chǎn)生腹水。 （5）腹水抗體的制備、純化：將抗體CSPG4-0711的雜交瘤細(xì)胞，注入pristane（降植烷）致敏的BALB/C小鼠腹腔，收集腹水，采用MCSP包被的ELISA法測腹水抗體效價(jià)可達(dá)1:32000；采用辛酸-硫酸銨沉淀法和親和層析柱純化腹水抗體，經(jīng)Bradford法測定抗體蛋白濃度。收集8ml腹水用辛酸-硫酸銨沉淀法初步純化獲得3ml抗體，濃度為2.6mg/ml；再用ProteinG柱層析法精制純化獲得抗體5.2mg，濃度為1.6mg/ml。 （6）雜交瘤細(xì)胞鑒定：采用秋水仙素阻斷法，在顯微鏡下計(jì)數(shù)染色體數(shù)，CSPG4-0711的雜交瘤細(xì)胞染色體數(shù)均數(shù)為66條。 （7）抗體的理化性質(zhì)鑒定：純化的抗體采用常規(guī)SDS-PAGE電泳方法（分離膠濃度為10%）鑒定純度和分子量，經(jīng)二硫蘇糖醇（DTT）還原的純化抗體，在50KD和25KD處有兩條帶，證明為Ig；電泳圖背景干凈、條帶清晰，表明純化抗體純度較高。 （8）抗體的免疫學(xué)結(jié)合性質(zhì)鑒定： ①抗原抑制試驗(yàn)：將不同濃度MCSP與固定濃度的CSPG4-0711混合，用Cell-ELISA法測定MCSP預(yù)先處理是否抑制CSPG4-0711抗體與MV3細(xì)胞結(jié)合。在濃度范圍（5～160μg/ml）內(nèi)，MCSP呈劑量依賴性地抑制抗體與MCSP表達(dá)陽性的MV3細(xì)胞的結(jié)合，表明抗體與MCSP結(jié)合具有特異性。 ②流式細(xì)胞分析法鑒定抗體與細(xì)胞表面MCSP結(jié)合：CSPG4-0711抗體與MV3細(xì)胞結(jié)合反應(yīng)陽性，MFI（平均熒光強(qiáng)度）：45.73～1191.32，且呈抗體劑量（0.5～10μg/ml）依賴性；而與1520細(xì)胞結(jié)合反應(yīng)陰性，MFI：7.81～4.58。 ③免疫熒光染色法鑒定抗體與細(xì)胞表面MCSP結(jié)合：免疫熒光法顯示CSPG4-0711抗體能染色MCSP+的MV3細(xì)胞，在細(xì)胞表面呈現(xiàn)綠色熒光，而不能染色MCSP-的1520細(xì)胞。 （9）RT-PCR檢測人乳腺癌細(xì)胞株中MCSP mRNA的表達(dá)：設(shè)計(jì)MCSP片段引物，采用RT-PCR檢測MCSP mRNA在一些人乳腺癌細(xì)胞株和人黑色素瘤細(xì)胞株中表達(dá)情況。在人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231、MDA-MB-435s中MCSPmRNA表達(dá)呈陽性，而MCF-7、T47D細(xì)胞呈陰性，MDA-MB-231、MDA-MB-435s細(xì)胞為三陰性乳腺癌細(xì)胞；在人黑色素瘤細(xì)胞株M21、MV3中為MCSP mRNA表達(dá)呈陽性，而1520、M14細(xì)胞呈陰性。這與前述ELISA、流式細(xì)胞分析、免疫熒光染色結(jié)果一致。 （10）CSPG4-0711抗體與人三陰性乳腺癌細(xì)胞的結(jié)合：流式細(xì)胞分析法顯示：CSPG4-0711抗體可與MBA-MD-231細(xì)胞、MBA-MD-435s等人三陰性乳腺癌細(xì)胞株結(jié)合，不與MCF-7、T47D等非三陰性人乳腺癌細(xì)胞株結(jié)合，這與RT-PCR結(jié)果一致。 3通過以上實(shí)驗(yàn)，可得以下結(jié)論 我們采用小鼠雜交瘤技術(shù)研制出一組能特異性結(jié)合MCSP以及MCSP表達(dá)陽性的人黑色素瘤細(xì)胞的單克隆抗體，其中CSPG4-0711單抗表現(xiàn)出高親和力、特異性結(jié)合MCSP活性。初步研究顯示：CSPG4-0711單抗也能結(jié)合人三陰性乳腺癌細(xì)胞株，提示該抗體可用于MCSP在三陰性乳腺癌表達(dá)、生物學(xué)功能以及靶向治療研究。進(jìn)一步研究在進(jìn)行之中。
【關(guān)鍵詞】：MCSP CSPG4 HMW-MAA 單克隆抗體 人乳腺癌 人黑色素瘤
【學(xué)位授予單位】：廣東藥學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R392
【目錄】：

• 中文摘要4-8
• 英文摘要8-12
• 前言及研究背景12-14
• 第一部分 免疫原的鑒定及動物免疫14-24
• 第一章 免疫原的制備及鑒定14-19
• 第二章 動物的免疫程序及鑒定19-24
• 第二部分 雜交瘤細(xì)胞株篩選和建立24-39
• 第一章 篩選方法建立24-27
• 第二章 細(xì)胞融合及細(xì)胞培養(yǎng)27-31
• 第三章 雜交瘤細(xì)胞株篩選31-35
• 第四章 雜交瘤細(xì)胞的克隆及鑒定35-39
• 第三部分 腹水抗體制備及純化39-46
• 第一章 腹水抗體的制備39-41
• 第二章 腹水抗體的純化41-46
• 第四部分 抗體的免疫學(xué)鑒定46-54
• 第一章 SDS-PAGE 鑒定純化后抗體46-47
• 第二章 抗原抑制實(shí)驗(yàn)47-49
• 第三章 流式細(xì)胞分析法鑒定抗體與細(xì)胞表面 MCSP 結(jié)合49-51
• 第四章 免疫熒光染色法鑒定抗體與細(xì)胞表面 MCSP 結(jié)合51-54
• 第五部分 CSPG4-0711 抗體與人乳腺癌細(xì)胞結(jié)合的初步研究54-62
• 第一章 RT-PCR 表達(dá)人乳腺癌細(xì)胞株中 MCSP mRNA 的表達(dá)54-60
• 第二章 流式細(xì)胞分析法檢測人乳腺癌細(xì)胞表面 MCSP 的表達(dá)60-62
• 總結(jié)與展望62-64
• 附錄64-65
• 參考文獻(xiàn)65-68
• 攻讀學(xué)位論文期間發(fā)表相關(guān)論文68-69
• 綜述69-75
• 參考文獻(xiàn)73-75
• 致謝75

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：415931