本文關(guān)鍵詞：人羊膜上皮細(xì)胞干預(yù)脂多糖誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞向M1極化及其機(jī)制初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的探討人羊膜上皮細(xì)胞(human amniotic epithelial cell, H-AEC)預(yù)防RAW264.7細(xì)胞在脂多糖(1ipopolysaccharide, LPS)誘導(dǎo)后向M1極化的作用和可能機(jī)制以及比較H-AEC、羊膜間充質(zhì)細(xì)胞(human amniotic mesenchymal cell, HA-MSC)和臍帶間充質(zhì)細(xì)胞(Umbilical mesenchymal stem cells, UC-MSC)分泌的細(xì)胞因子對(duì)脂多糖刺激巨噬細(xì)胞系RAW264.7炎癥狀態(tài)的影響。為H-AEC在治療炎癥相關(guān)疾病的臨床應(yīng)用上提供理論基礎(chǔ)。 方法 細(xì)胞的分離和培養(yǎng)：通過(guò)胰酶(Trypsin/EDTA,T/E)消化法作用人胎盤(pán)羊膜,分離H-AEC；通過(guò)透明質(zhì)酸酶(Hyaluronidase, H),中性蛋白酶(Dispase, D)以及膠原蛋白酶(Collagenase,C)三酶聯(lián)合消化法分別從人胎盤(pán)羊膜和臍帶中分離HA-MSC和UC-MSC。 實(shí)驗(yàn)分組：(1)H-AEC干預(yù)LPS刺激RAW264.7極化實(shí)驗(yàn)分組：①空白對(duì)照組：RAW264.7正常培養(yǎng)48小時(shí)；②陽(yáng)性對(duì)照組：RAW264.7正常培養(yǎng)48小時(shí)后100ng/ml LPS刺激4小時(shí)；③干預(yù)對(duì)照組：AW264.7(2.5×105)和H-AEC (5×105) Transwell共培養(yǎng)48小時(shí)；④實(shí)驗(yàn)組:RAW264.7(2.5×105)和H-AEC (5×105) Transwell共培養(yǎng)48小時(shí)后100ng/ml LPS刺激4小時(shí)。 (2)比較H-AEC、HA-MSC、UC-MSC干預(yù)LPS刺激RAW264.7極化實(shí)驗(yàn)分組：①陽(yáng)性對(duì)照組：RAW264.7正常培養(yǎng)48小時(shí)后100ng/ml LPS刺激4小時(shí)；②H-AEC組：RAW264.7(2.5×105)和H-AEC (5×105) Transwell共培養(yǎng)48小時(shí)后100ng/ml LPS刺激4小時(shí)；③HA-MSC組：RAW264.7(2.5×105)和A-MSC(5×105)Transwell共培養(yǎng)48小時(shí)后100ng/ml LPS刺激4小時(shí)；④UC-MSC組：RAW264.7(2.5×105)和UC-MSC (5×105) Transwell共培養(yǎng)48小時(shí)后100ng/ml LPS刺激4小時(shí)。 檢測(cè)方法：細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組RAW264.7細(xì)胞的遷移能力；一氧化氮檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組RAW264.7細(xì)胞分泌NO的水平；用實(shí)時(shí)定量多聚酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-PCR)檢測(cè)各組細(xì)胞經(jīng)典激活的巨噬細(xì)胞(classically activated macrophage, M1macrophage)相關(guān)的促炎基因以及旁路活化的巨噬細(xì)胞(alternatively activated macrophage, M2macrophage)相關(guān)的抑炎基因表達(dá)情況；Western blotting檢測(cè)(1)中各組RAW264.7胞質(zhì)蛋白p-IκBa以及胞核蛋白NFκB的表達(dá)；ELISA檢測(cè)各組TGF-p1的分泌情況。 結(jié)果(1)實(shí)驗(yàn)組RAW264.7細(xì)胞遷移率為14.7%±4.5%,與陽(yáng)性對(duì)照組(31.1%±11.0%)相比,差異具有顯著性(p0.05)。HA-MSC、UC-MSC組遷移率分別為14.7%±4.5%、9.6%±0.7%、13.0%±0.9%,與陽(yáng)性對(duì)照組相比,差異具有顯著性(p0.05),但三組實(shí)驗(yàn)組無(wú)明顯差異(p0.05)。(2)實(shí)驗(yàn)組共培養(yǎng)后RAW264.7細(xì)胞分泌NO的水平為24.26±0.72μM/L,與陽(yáng)性對(duì)照組(45.65±1.78μM/L)差異具有顯著性(p0.05)。 HA-MSC、UC-MSC組NO濃度為44.52±2.51μM/L、42.25±0.76μM/L,與陽(yáng)性對(duì)照組無(wú)顯著性差異(p0.05)。(3)促炎基因與抑炎基因的表達(dá)改變：(A)實(shí)驗(yàn)組(H-AEC組)IL-1β、TNFa、NOS-2、INFβ等M1基因表達(dá)下調(diào),CD206、CD36、Arg-1等M2基因表達(dá)上調(diào),與陽(yáng)性對(duì)照組相比有顯著差別；(B)HA-MSC、UC-MSC組促炎基因INFp表達(dá)下調(diào)顯著,其余基因均上調(diào)表達(dá)；抑炎相關(guān)基因如Arg-1、CD206、CD36均上調(diào)；三組細(xì)胞干預(yù)后抑炎癥相關(guān)基因Arg-1、CD206、CD36表達(dá)均上調(diào),與對(duì)照組有顯著差異。(4)實(shí)驗(yàn)組降低了RAW264.7細(xì)胞中LPS激活的經(jīng)典炎性通路NFκB上胞質(zhì)蛋白p-IκBa以及胞核蛋白NFκB的表達(dá)量。(5)實(shí)驗(yàn)組下室TGF-p1分泌量大于上室,兩者都大于H-AEC自身TGF-β1分泌量。 結(jié)論人羊膜上皮細(xì)胞能有效抑制LPS刺激下的RAW264.7向M1極化且M2相關(guān)基因表達(dá)上調(diào),其機(jī)制可能是通過(guò)抑制IκBa磷酸化阻止NFκB進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)啟動(dòng)M1型相關(guān)基因的表達(dá)。人羊膜上皮細(xì)胞、羊膜間充質(zhì)細(xì)胞和臍帶間充質(zhì)細(xì)胞可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞向2型分化,但其效果和機(jī)制存在不同。
【關(guān)鍵詞】：羊膜上皮細(xì)胞 羊膜間充質(zhì)細(xì)胞 臍帶間充質(zhì)細(xì)胞 脂多糖 M1巨噬細(xì)胞 M2巨噬細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R329.2
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-12
• 中英文對(duì)照12-13
• 前言13-16
• 1 羊膜上皮細(xì)胞以及間充質(zhì)細(xì)胞具有減輕炎癥和調(diào)節(jié)免疫的作用13
• 2 巨噬細(xì)胞的極化表型及相應(yīng)的功能特征13-14
• 3 巨噬細(xì)胞極化現(xiàn)象與疾病的關(guān)系14
• 4 H-AEC作用巨噬細(xì)胞的可能途徑14-16
• 第一章 H-AEC、HA-MSC、UC-MSC的分離、鑒定和培養(yǎng)16-22
• 1 材料和方法16-20
• 1.1 材料與試劑16-17
• 1.2 試劑配制17
• 1.3 主要儀器17-18
• 1.4 分離、鑒定、培養(yǎng)的方法18-20
• 2 結(jié)果20
• 3 討論20
• 4 結(jié)論20-21
• 附圖21-22
• 第二章 人羊膜上皮細(xì)胞干預(yù)脂多糖刺激的RAW264.7細(xì)胞向M1極化及其初步機(jī)制22-35
• 1 材料和方法22-28
• 1.1 材料與試劑22-23
• 1.2 試劑配制23-24
• 1.3 主要儀器24-25
• 1.4 實(shí)驗(yàn)方法25-28
• 2 結(jié)果28-29
• 2.1 RAW264.7細(xì)胞的鑒定28
• 2.2 RAW264.7細(xì)胞遷移率實(shí)驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異28
• 2.3 羊膜上皮細(xì)胞能減少LPS刺激下RAW264.7 NO的分泌28
• 2.4 H-AEC能使LPS刺激下的M1型RAW264.7轉(zhuǎn)變?yōu)镸2型28-29
• 2.5 H-AEC可能通過(guò)抑制NFKB通路抑制RAW264.7 M1型相關(guān)基因的表達(dá)29
• 2.6 H-AEC可能通過(guò)分泌TGF-β1抑制RAW264.7 M1型相關(guān)基因或促進(jìn)M2型相關(guān)基因表達(dá)29
• 3 結(jié)論29
• 4 討論29-31
• 附圖31-35
• 第三章 三種成體干細(xì)胞對(duì)脂多糖誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞炎癥狀態(tài)的不同作用比較35-42
• 1 材料和方法35-37
• 1.1 材料和試劑35-36
• 1.2 主要儀器36
• 1.3 實(shí)驗(yàn)方法36-37
• 2 結(jié)果37-38
• 2.1 H-AEC、HA-MSC、UC-MSC處理對(duì)RAW264.7遷移率的影響37
• 2.2 HAEC共培養(yǎng)后能降低LPS刺激的RAW264.7分泌NO37
• 2.3 H-AEC、HA-MSC、UC-MSC處理對(duì)RAW264.7細(xì)胞M1、M2相關(guān)基因表達(dá)的不同作用37-38
• 3 結(jié)論38
• 4 討論38-40
• 附圖40-42
• 參考文獻(xiàn)42-46
• 綜述46-52
• 參考文獻(xiàn)49-52
• 攻讀學(xué)位期間主要的研究成果52-53
• 致謝53

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：401400