目的：克隆細(xì)粒棘球絳蟲AgB8/3(EgAgB8/3)抗原基因編碼片段，構(gòu)建有自切功能的原核表達(dá)載體pTWIN1-EgAgB8/3，并進(jìn)行表達(dá)條件的優(yōu)化和初步純化，獲得較純的EgAgB8/3重組抗原(rEgAgB8/3)，制備抗rEgAgB8/3抗原的多克隆抗體，通過ELISA-雙抗夾心法檢測(cè)棘球絳蟲感染犬糞EgAgB8/3天然抗原并對(duì)其診斷價(jià)值進(jìn)行評(píng)估。方法：根據(jù)Genebank登陸號(hào)(AF362442)下載目的基因核酸序列，利用DNAman軟件設(shè)計(jì)引物，以實(shí)驗(yàn)室?guī)齑娴膒ET32a-EgAgB8/3重組載體為模板，對(duì)EgAgB8/3編碼分泌型多肽片段的核酸序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，構(gòu)建pEASY-T1-EgAgB8/3重組質(zhì)粒，經(jīng)PCR、酶切及測(cè)序鑒定后，將EgAgB8/3抗原基因片段定向連入原核表達(dá)質(zhì)粒pTWIN1(+)上，將重組子pTWIN1-EgAgB8/3轉(zhuǎn)化入E.coli DH5α，根據(jù)選擇標(biāo)記的氨芐青霉素抗性基因篩選到陽性克隆后將pTWIN1-EgAgB8/3重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至大腸桿菌E.coli ER2566，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)CBD-intein1-EgAgB8/3融合蛋白，通過...

【文章頁數(shù)】：72 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖1EgAgB8/3PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

結(jié)果表達(dá)蛋白3抗原目的基因的克隆基因分泌型多肽片段核酸序列的PCR擴(kuò)增結(jié)果:pET32a-EgAgB8/3模板，P1和P2為引物擴(kuò)增后8/3DNA片段，與預(yù)測(cè)片段大小相符(圖1)。

圖2菌落藍(lán)白斑篩選結(jié)果

與預(yù)測(cè)片段大小相符(圖1)。圖1EgAgB8/3PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1PCRproductofEgAgB8/3：DL2000DNAmaker；1~2：PCRprod連接T載體轉(zhuǎn)化后提取質(zhì)粒pEASY-T1載體相連接轉(zhuǎn)化E.co克隆菌落(如圖....

圖3pEASY-T1-EgAgB8/30.7%瓊脂糖凝膠電泳Fig.3PCRproductweresize-separatedona1%agarosegel

圖3pEASY-T1-EgAgB8/30.7%瓊脂糖凝膠電泳PCRproductweresize-separatedona1%agarExampleofpEASY-T1-EgAgB8/3gB8/3重組質(zhì)粒PCR和酶切鑒定試劑盒提取經(jīng)藍(lán)白斑篩選的陽....

圖6pEASY-T1-EgAgB8/3測(cè)序圖譜

圖6pEASY-T1-EgAgB8/3測(cè)序圖譜Fig.6pEASY-T1-EgAgB8/3sequencingmap1.2.5pEASY-T1-EgAgB8/3重組質(zhì)粒與pTWIN1空載體雙酶切分別用EcoRI和BamHI雙酶切質(zhì)粒pTWIN1....

本文編號(hào)：3964320