目的：構(gòu)建人抗菌肽FALL-39的原核表達系統(tǒng)，解決抗菌肽獲取困難的難題；用PCR定點突變法構(gòu)建人抗菌肽FALL-39基因突變體，并比較研究FALL-39及其突變肽的功能。方法：應用RT-PCR從人肺腺上皮細胞株SPC-A-1總RNA中擴增FALL-39成熟肽cDNA，以pGEX-1λT為載體，構(gòu)建抗菌肽FALL-39基因大腸桿菌表達載體；采用一步法和兩步法PCR體外定點突變技術(shù)，用賴氨酸替代第24位的谷氨酰胺和／或第32位的天門冬氨酸，構(gòu)建FALL-39突變體大腸桿菌表達載體；該載體表達的融合蛋白經(jīng)親合層析、凝血酶酶切、膠回收和高效液相色譜分離純化，獲得高度純化的重組FALL-39以及突變肽；對純化產(chǎn)物進行的MEC、MIC、MBC和溶血性實驗等比較抗菌作用以及對紅細胞膜的溶解性，用RT-PCR測定人單核巨噬細胞株THP-1 iNOS的表達，研究FALL-39及其突變肽的抗內(nèi)毒作用。結(jié)果：重組質(zhì)粒pGEX-1λT-FALL-39測序結(jié)果說明其插入片段序列與GenBank登錄的FALL-39基因的cDNA序列相符，且插入方向正確；DNA測序結(jié)果表明在預期位點發(fā)生突變，用一步法得到突變體質(zhì)...

【文章頁數(shù)】：123 頁

【學位級別】：博士

【部分圖文】：

圖1一1SPC一A一1細胞總RNA電泳圖

2.1總RNA的提取提取細胞的總RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測有兩個明顯條帶(285和185)，基本無降解，無DNA殘留和蛋白質(zhì)污染(圖1一1)。2·2RT-PCR擴增結(jié)果以提取的RNA為模板用設計的特異引物進行Rl’-PCR擴增，所獲得的擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖電泳檢查為一條約14....

圖3一5LL3，及其突變蛋白AU一以GE電泳圖

2.2FALL一39及其突變體活性蛋白的純化凝血酶酶切融合蛋白混合溶液用AU一隊GE加以分離，可從融合蛋白中分離出FALL一39及其突變的陽離子膚(圖3一5)。L「24L「32L「24，32，.心“-圖3一5FALL3，及其突變蛋白AU一以GE電泳圖Fig.3一5AU一PAGEo....

圖3一7HPLC純化的FALL-39及其突變膚Trieine-SDS-PAGE.一

由于突變膚所攜帶陽離子電荷多(見表3一l)，因此在AU一PAGE電泳中電泳速度較FALL一39快，其中FALL一39一Lys24’32的電泳速度最快(圖3一5)。應用OMIGA蛋白分析軟件分析隊LL一39及其突變膚，顯示FALL一39基本為一線性結(jié)構(gòu)，突變后親疏水性、Q螺旋結(jié)構(gòu)等....

圖4一6FALL39及其突變膚對LPS介導的THP.liNOSmRNA表達的影響

uo﹃的的.﹄dx國」…L圖4一7FALL一39及其突變膚對LPS介導的THP一liNOSmRNA表達的影響Fig·4一7InhibitoryeffeetofFALL39anditsmutantPeptidesonLpS一mediatediNOSmRNAexPressioninT....

本文編號：3955616