目的：構(gòu)建人抗菌肽FALL-39的原核表達(dá)系統(tǒng)，解決抗菌肽獲取困難的難題；用PCR定點(diǎn)突變法構(gòu)建人抗菌肽FALL-39基因突變體，并比較研究FALL-39及其突變肽的功能。方法：應(yīng)用RT-PCR從人肺腺上皮細(xì)胞株SPC-A-1總RNA中擴(kuò)增FALL-39成熟肽cDNA，以pGEX-1λT為載體，構(gòu)建抗菌肽FALL-39基因大腸桿菌表達(dá)載體；采用一步法和兩步法PCR體外定點(diǎn)突變技術(shù)，用賴氨酸替代第24位的谷氨酰胺和／或第32位的天門冬氨酸，構(gòu)建FALL-39突變體大腸桿菌表達(dá)載體；該載體表達(dá)的融合蛋白經(jīng)親合層析、凝血酶酶切、膠回收和高效液相色譜分離純化，獲得高度純化的重組FALL-39以及突變肽；對(duì)純化產(chǎn)物進(jìn)行的MEC、MIC、MBC和溶血性實(shí)驗(yàn)等比較抗菌作用以及對(duì)紅細(xì)胞膜的溶解性，用RT-PCR測(cè)定人單核巨噬細(xì)胞株THP-1 iNOS的表達(dá)，研究FALL-39及其突變肽的抗內(nèi)毒作用。結(jié)果：重組質(zhì)粒pGEX-1λT-FALL-39測(cè)序結(jié)果說(shuō)明其插入片段序列與GenBank登錄的FALL-39基因的cDNA序列相符，且插入方向正確；DNA測(cè)序結(jié)果表明在預(yù)期位點(diǎn)發(fā)生突變，用一步法得到突變體質(zhì)...

【文章頁(yè)數(shù)】：123 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

圖1一1SPC一A一1細(xì)胞總RNA電泳圖

2.1總RNA的提取提取細(xì)胞的總RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)有兩個(gè)明顯條帶(285和185)，基本無(wú)降解，無(wú)DNA殘留和蛋白質(zhì)污染(圖1一1)。2·2RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果以提取的RNA為模板用設(shè)計(jì)的特異引物進(jìn)行Rl’-PCR擴(kuò)增，所獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖電泳檢查為一條約14....

圖3一5LL3，及其突變蛋白AU一以GE電泳圖

2.2FALL一39及其突變體活性蛋白的純化凝血酶酶切融合蛋白混合溶液用AU一隊(duì)GE加以分離，可從融合蛋白中分離出FALL一39及其突變的陽(yáng)離子膚(圖3一5)。L「24L「32L「24，32，.心“-圖3一5FALL3，及其突變蛋白AU一以GE電泳圖Fig.3一5AU一PAGEo....

圖3一7HPLC純化的FALL-39及其突變膚Trieine-SDS-PAGE.一

由于突變膚所攜帶陽(yáng)離子電荷多(見(jiàn)表3一l)，因此在AU一PAGE電泳中電泳速度較FALL一39快，其中FALL一39一Lys24’32的電泳速度最快(圖3一5)。應(yīng)用OMIGA蛋白分析軟件分析隊(duì)LL一39及其突變膚，顯示FALL一39基本為一線性結(jié)構(gòu)，突變后親疏水性、Q螺旋結(jié)構(gòu)等....

圖4一6FALL39及其突變膚對(duì)LPS介導(dǎo)的THP.liNOSmRNA表達(dá)的影響

uo﹃的的.﹄dx國(guó)」…L圖4一7FALL一39及其突變膚對(duì)LPS介導(dǎo)的THP一liNOSmRNA表達(dá)的影響Fig·4一7InhibitoryeffeetofFALL39anditsmutantPeptidesonLpS一mediatediNOSmRNAexPressioninT....

本文編號(hào)：3955616