�、� 食源性致病菌嚴(yán)重危害著食品安全和人類健康,沙門氏菌和副溶血弧菌是兩種常見的食源性致病菌。副溶血弧菌廣泛分布在世界各地的河口、沿海岸和海洋,是海產(chǎn)品引發(fā)食源性疾病最重要的因素。沙門氏菌存在于多種食物中,包括肉、蛋類、奶制品、蔬菜等,可以通過這些食物進入人體,引起傷寒發(fā)熱、沙門氏菌病等疾病爆發(fā)。致病菌感染與細(xì)菌血清型有著重要的關(guān)系,對致病菌血清型的鑒定對疾病評估、感染的控制和流行病學(xué)調(diào)查有著重要意義。 本研究完成了副溶血弧菌O血清型決定簇基因序列的破譯,篩選出副溶血弧菌所有13種O血清型的特異基因,建立了副溶血弧菌O血清型分型的多重PCR分子分型方法。這一方法經(jīng)41株副溶血弧菌、21株其它種屬細(xì)菌驗證,具有很好的特異性。對從上海地區(qū)海產(chǎn)品中分離到的105份環(huán)境樣品進行雙盲實驗檢測,均得到正確的結(jié)果。靈敏度實驗表明,該檢測方法可以檢測出1ng的基因組DNA,未經(jīng)富集培養(yǎng)的細(xì)菌可以在104CFU/ml的水平被檢測到,1CFU/ml的細(xì)菌經(jīng)過富集培養(yǎng)也完全可以得到正確鑒定。每克牡蠣制備的模擬實際樣品中含有2到8個CFU的細(xì)菌初始量即可通過我們的PCR體系檢測到。 另外我們建立了針對沙門氏菌所...

【文章頁數(shù)】：156 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一部分 沙門氏菌和副溶血弧菌基于O血清型分型的分子檢測方法的建立
    第一章 引言
        第一節(jié) 研究背景簡介
            1.1.1 食源性致病菌的研究背景
                1.1.1.1 食源性疾病
                1.1.1.2 食源性疾病的誘因
            1.1.2 兩種重要的食源性致病菌
                1.1.2.1 沙門氏菌
                    1.1.2.1.1 沙門氏菌的生物學(xué)特性
                    1.1.2.1.2 沙門氏菌的危害性
                    1.1.2.1.3 沙門氏菌引發(fā)的的疾病爆發(fā)
                1.1.2.2 副溶血弧菌
                    1.1.2.2.1 副溶血弧菌的生物學(xué)特性
                    1.1.2.2.2 副溶血弧菌的致病性
                    1.1.2.2.3 副溶血弧菌的毒力因子
                    1.1.2.2.4 副溶血弧菌的流行性
                    1.1.2.2.5 副溶血弧菌的遺傳學(xué)研究
            1.1.3 食源性致病菌的檢測方法
                1.1.3.1 傳統(tǒng)檢測方法
                1.1.3.2 免疫學(xué)方法
                1.1.3.3 分子生物學(xué)方法
            1.1.4 微生物檢測的靶基因選擇
            1.1.5 革蘭氏陰性菌O抗原研究進展
                1.1.5.1 革蘭氏陰性菌脂多糖
                1.1.5.2 O抗原的功能和結(jié)構(gòu)
                1.1.5.3 沙門氏菌的O抗原研究
                1.1.5.4 副溶血弧菌的O抗原研究
        第二節(jié) 本項工作的研究目標(biāo)、內(nèi)容和創(chuàng)新性
            1.2.1 研究目標(biāo)
            1.2.2 研究內(nèi)容
                1.2.2 1 副溶血弧菌O血清型分型多重PCR方法
                1.2.2.2 沙門氏菌46種O血清型分型芯片
            1.2.3 本研究的創(chuàng)新性
    第二章 材料與方法
        第一節(jié) 實驗材料
            2.1.1 菌株
                2.1.1.1 用于副溶血弧菌多重PCR檢測方法研制的菌株
                    2.1.1.1.1 用于篩選特異基因的副溶血弧菌菌株
                    2.1.1.1.2 用于多重PCR特異性評價的其它種屬菌株
                    2.1.1.1.3 用于特異性驗證的實際樣品來源
                2.1.1.2 用于研制沙門氏菌46種O血清群分型芯片的菌株
                    2.1.1.2.1 用于篩選特異基因及芯片評價實驗的沙門氏菌
                    2.1.1.2.2 用于特異性評價試驗的其它種屬菌株
                2.1.1.3 用于DNA文庫構(gòu)建克隆的受體菌株
            2.1.2 質(zhì)粒
            2.1.3 引物和探針
            2.1.4 主要酶與試劑
            2.1.5 實驗儀器
        第二節(jié) 實驗方法
            2.2.1 培養(yǎng)基及一些基本試劑的配置
                2.2.1.1 2YT培養(yǎng)基及固體培養(yǎng)基的配制
                2.2.1.2 抗生素和一些酶制劑的配置
            2.2.2 細(xì)菌基因組DNA的提取
            2.2.3 鳥槍法DNA文庫的構(gòu)建
                2.2.3.1 O血清型決定簇的擴增及產(chǎn)物的純化
                    2.2.3.1.1 PCR反應(yīng)體系
                    2.2.3.1.2 PCR程序
                    2.2.3.1.3 PCR產(chǎn)物的檢測
                    2.2.3.1.4 PCR產(chǎn)物純化
                2.2.3.2 DNA產(chǎn)物片段化及補平、連接反應(yīng)
                    2.2.3.2.1 DNA產(chǎn)物片段化
                    2.2.3.2.2 DNA片段化產(chǎn)物的補平
                    2.2.3.2.3 與質(zhì)粒的連接反應(yīng)
                2.2.3.3 連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化及質(zhì)粒提取
                    2.2.3.3.1 感受態(tài)細(xì)胞制備
                    2.2.3.3.2 電轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物
                    2.2.3.3.3 質(zhì)粒提取
                2.2.3.4 構(gòu)建的DNA文庫測序
                    2.2.3.4.1 ABI測序
                    2.2.3.4.2 核苷酸序列拼接
                    2.2.3.4.3 生物信息學(xué)方法進行序列分析
            2.2.4 Solexa/Illumina測序
                2.2.4.1 Solexa Paired-end樣品制備
                2.2.4.2 Solexa雙末端測序
                2.2.4.3 Solexa測序序列拼接
            2.2.5 特異基因的篩選
                2.2.5.1 副溶血弧菌特異基因的篩選
                2.2.5.2 沙門氏菌特異基因的篩選
            2.2.6 多重PCR體系的建立
                2.2.6.1 副溶血弧菌多重PCR體系
                2.2.6.2 沙門氏菌多重PCR體系
            2.2.7 基因芯片的研制
                2.2.7.1 沙門氏菌基因芯片的點制
                2.2.7.2 芯片雜交
                    2.2.7.2.1 多重PCR產(chǎn)物純化
                    2.2.7.2.2 熒光標(biāo)記
                    2.2.7.2.3 雜交反應(yīng)
                    2.2.7.2.4 芯片掃描
            2.2.8 模擬樣品實驗
                2.2.8.1 副溶血弧菌模擬樣品實驗
                2.2.8.2 沙門氏菌模擬樣品實驗
    第三章 結(jié)果與分析
        (Ⅰ)副溶血弧菌多重PCR分子分型方法建立
            第一節(jié) 副溶血弧菌O2,O6,O9,O10,O11,O13 O血清型決定簇的分子鑒定和進化分析
                3.1.1 副溶血弧菌O血清型決定簇序列的獲得
                3.1.2 副溶血弧菌O2O血清型決定簇的鑒定
                3.1.3 副溶血弧菌O6O血清型決定簇的鑒定
                3.1.4 副溶血弧菌O9O血清型決定簇的鑒定
                3.1.5 副溶血弧菌O10O血清型決定簇的鑒定
                3.1.6 副溶血弧菌O11O血清型決定簇的鑒定
                3.1.7 副溶血弧菌O13O血清型決定簇的鑒定
            第二節(jié) 特異引物的篩選及多重PCR體系的確立
                3.2.1 副溶血弧菌13種O血清型特異引物的篩選
                    3.2.1.1 副溶血弧菌O血清型決定簇序列分析
                    3.2.1.2 副溶血弧菌高度相似O血清型序列比對分析
                    3.2.1.3 副溶血弧菌O血清型特異引物篩選
                3.2.2 副溶血弧菌多重PCR體系建立
            第三節(jié) 副溶血弧菌多重PCR體系性能評價實驗
                3.3.1 多重PCR體系特異性實驗
                    3.3.1.1 副溶血弧菌和其它種屬菌株的特異性檢測結(jié)果
                    3.3.1.2 分離自臨床樣品中的副溶血弧菌雙盲樣品檢測結(jié)果
                3.3.2 靈敏度實驗
                    3.3.2.1 DNA靈敏度
                    3.3.2.2 菌數(shù)靈敏度
                3.3.3 模擬樣品實驗
        (Ⅱ)沙門氏菌46種O血清群分子分型基因芯片的研制
            第二節(jié) 特異引物的篩選和多重PCR體系確立
                3.1.1 沙門氏菌O血清群特異引物的設(shè)計
                    3.1.1.1 沙門氏菌O抗原基因簇序列分析
                    3.1.1.2 沙門氏菌相似度較高的幾個O抗原基因簇序列比較
                    3.1.1.3 沙門氏菌和相似度較高的大腸桿菌O抗原基因簇
                    3.1.1.4 沙門氏菌46個血清群特異基因的篩選
                    3.1.1.5 沙門氏菌特異引物的設(shè)計和篩選
                3.1.2 用于擴增靶基因的多重PCR的設(shè)計和優(yōu)化
            第二節(jié) 沙門氏菌46種O血清群探針的設(shè)計和篩選
                3.2.1 特異探針的設(shè)計
                3.2.2 特異探針的篩選
            第三節(jié) 沙門氏菌芯片性能評價實驗
                3.3.1 沙門氏菌芯片特異性實驗
                    3.3.1.1 所有的沙門氏菌雜交結(jié)果
                    3.3.1.2 非沙門氏菌菌株雜交結(jié)果
                3.3.2 沙門氏菌芯片靈敏度實驗
                    3.3.2.1 DNA靈敏度實驗
                    3.3.2.2 菌數(shù)度靈敏度實驗
                3.3.3 沙門氏菌芯片雙盲實驗
                3.3.4 沙門氏菌芯片模擬樣品實驗
    第四章 結(jié)論與討論
第二部分 兩株不同宿主來源的大腸桿菌O156：H25的比較基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究
    第一章 引言
        第一節(jié) 研究背景簡介
            1.1.1 微生物基因組學(xué)研究進展
                1.1.1.1 基因組
                1.1.1.2 基因組學(xué)
                1.1.1.3 基因組學(xué)的研究策略
                1.1.1.4 功能基因組學(xué)
                1.1.1.5 比較基因組學(xué)
            1.1.2 微生物轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究進展
                1.1.2.1 轉(zhuǎn)錄組學(xué)
                1.1.2.2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究策略
            1.1.3 DNA測序技術(shù)發(fā)展
                1.1.3.1 第一代測序法
                    1.1.3.1.1 Sanger雙脫氧鏈末端終止法測序
                    1.1.3.1.2 Gilbert化學(xué)裂解法
                    1.1.3.1.3 焦磷酸測序技術(shù)
                1.1.3.2 第二代測序技術(shù)
                    1.1.3.2.1 454 GS FLX測序技術(shù)
                    1.1.3.2.2 Solexa測序技術(shù)
                    1.1.3.2.3 ABI測序技術(shù)
                1.1.3.3 第三代測序技術(shù)
            1.1.4 腸道致病性大腸桿菌研究進展
                1.1.4.1 腸出血性大腸桿菌的致病因子
                1.1.4.2 腸出血性大腸桿菌的致病機制
                1.1.4.3 LEE致病島
                1.1.4.4 效應(yīng)子蛋白
                1.1.4.5 重要的致病因子
        第二節(jié) 本工作的研究內(nèi)容、目標(biāo)和創(chuàng)新性
            1.2.1 本實驗研究背景
            1.2.2 研究內(nèi)容
                1.2.2.1 E.coli O156：H25菌株的比較基因組學(xué)研究
                1.2.2.2 E.coli O156：H25菌株的比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究
            1.2.3 研究目標(biāo)
            1.2.4 創(chuàng)新性
    第二章 材料與方法
        第一節(jié) 實驗材料
            2.1.1 菌株
            2.1.2 細(xì)胞株
            2.1.3 試劑
        第二節(jié) 實驗方法
            2.2.1 基因組測序
            2.2.2 基因組序列拼接
            2.2.3 基因預(yù)測和注釋
            2.2.4 基因組多序列比對分析
            2.2.5 轉(zhuǎn)錄組測序樣本制備
                2.2.5.1 樣本準(zhǔn)備
                2.2.5.2 RNA提取
                2.2.5.3 RNA純化和富集
                2.2.5.4 RNA文庫構(gòu)建
                2.2.5.5 轉(zhuǎn)錄組測序
                2.2.5.6 轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果處理
            2.2.6 細(xì)胞粘附實驗
                2.2.6.1 細(xì)胞培養(yǎng)
                2.2.6.2 細(xì)胞粘附
            2.2.7 細(xì)菌動力實驗
    第三章 結(jié)果與分析
        第一節(jié) 基因組學(xué)比較
            2.1.1 PT199和CB647基本特性差別
            2.1.2 PT199和CB647基因組概況
            2.1.3 PT199和CB647比較
                2.1.3.1 特異基因分析
                2.1.3.2 Snp和假基因分析
                2.1.3.3 效應(yīng)子蛋白比較
            2.1.4 12株E.coli O156：H25基因組比較
        第二節(jié) 轉(zhuǎn)錄組學(xué)比較
            2.2.1 PT199和CB647轉(zhuǎn)錄組
                2.2.1.1 吸附后基因表達變化
                2.2.1.2 PT199和CB647基因表達比較
            2.2.2 幾類與致病性相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄組變化
                2.2.2.1 LEE致病島轉(zhuǎn)錄組變化
                2.2.2.2 鞭毛相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄組變化
                2.2.2.3 菌毛相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄組變化
    第四章 結(jié)論與討論
參考文獻
致謝
個人簡歷、在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與研究成果



本文編號：3863856