平行模板法簡化重疊延伸PCR定點(diǎn)突變流程的思路不能成立,靠近DNA末端的低效限制性酶切才是制約其突變效率的核心原因。故以旁側(cè)引物法提高DNA產(chǎn)物的酶切效率,增加定點(diǎn)突變的成功率。將上、下游引物匹配位點(diǎn)由兩側(cè)酶切位點(diǎn)外延50-100 bp,使目標(biāo)基因兩端的酶切位點(diǎn)處于第二輪PCR產(chǎn)物的兩端近側(cè),而非末端。由此提高隨后的酶切效率,節(jié)省反應(yīng)時(shí)間。由于此時(shí)酶切會明顯縮短DNA長度,凝膠電泳結(jié)果顯示僅1 h就完成了對PCR產(chǎn)物的充分酶切。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌后形成的克隆數(shù)也明顯增加,且陽性率由33%-70%提高至100%。經(jīng)對比檢測,旁側(cè)引物法既節(jié)省了工作時(shí)間,也極大地提高了重疊延伸PCR定點(diǎn)突變過程中的菌落形成數(shù)與突變成功率。

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【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 材料
        1.1.1 菌種與質(zhì)粒
        1.1.2 試劑
    1.2 方法
        1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成
        1.2.2 PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因及陽性菌落檢測
        1.2.3 基因克隆與序列分析
2 結(jié)果
    2.1 平行模板法無法避免原始基因的擴(kuò)增
    2.2 兩種方案下目標(biāo)基因的擴(kuò)增
    2.3 突變體的克隆與鑒定
3 討論
4 結(jié)論



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