研究背景： 氯離子通道在細胞興奮性調(diào)節(jié)，跨上皮物質轉運，細胞容 積調(diào)節(jié)，細胞器酸化作用中發(fā)揮重要的作用，甚至在細胞免疫 應答，細胞遷移，細胞增殖和分化等過程中也有一定作用。這 種功能的多樣性對應于不同種類的氯離子通道，而且這些通道 由多種完全不同的基因編碼。電壓門控氯離子通道（ClC）是其中 的一類，而且ClC基因分布廣泛，存在于動物、植物、酵母和 細菌中。目前從哺乳動物細胞中已經(jīng)克隆得到了九種不同的ClC 通道。ClC通道的功能缺失或改變與人類的某些遺傳性疾病有 密切的關系，如先天性肌強直，腎結石，Bartter’s綜合征。ClC-1 氯離子通道（ClC-1）是第一個從哺乳動物中克隆得到的ClC通 道，其主要表達于骨骼肌，但在心臟、腎臟和平滑肌中也有少 第四軍醫(yī)大學博士論文 量表達。目前的研究結果表明，CIC－1 與先天性肌強直疾病關 系密切。 CIC＊作為哺乳動物中第一個發(fā)現(xiàn)的趴 通道，近十年來 ...

【文章頁數(shù)】：148 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
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英文摘要
1 文獻綜述
    1.1 ClC通道的生物學及相關疾病
        1.1.1 ClC通道的分類
        1.1.2 ClC通道的結構和典型特性
        1.1.3 ClC通道的生理作用和相關疾病
        1.1.4 結論
    1.2 ClC通道基因轉錄中剪接的多樣性及通道亞型
    1.3 ClC-1的研究進展評價
    1.4 C6細胞氯離子通道的研究現(xiàn)狀分析
2 問題提出及本文的研究目標和內(nèi)容
3 材料和方法
    3.1 細胞的培養(yǎng)
    3.2 離子通道cDNA的克隆方法
        3.2.1 引物設計
        3.2.2 細胞總mRNA的提取
        3.2.3 3'端的擴增
        3.2.4 5'端的擴增
        3.2.5 中間段的分段擴增
        3.2.6 cDNA的電泳、提純和測序
        3.2.7 GenBank數(shù)據(jù)庫檢索與擴增片段的確認
        3.2.8 cDNA質粒載體的構建和cDNA的亞克隆
        3.2.9 內(nèi)切酶的設計與cDNA片段的連接策略
        3.2.10 質粒的擴增和提純
    3.3 通道基因的體外轉錄
    3.4 非洲爪蟾卵母細胞的分離和培養(yǎng)
        3.4.1 爪蟾的飼養(yǎng)
        3.4.2 卵母細胞分離和培養(yǎng)用液體
        3.4.3 手術方法
        3.4.4 卵母細胞的分離
        3.4.5 卵母細胞的挑選
        3.4.6 卵母細胞的培養(yǎng)
    3.5 mRNA的納升注射與表達
    3.6 雙電極電壓鉗電生理實驗
        3.6.1 記錄的條件和方法
        3.6.2 記錄用液體
    3.7 數(shù)據(jù)分析的工具和方法
4 結果
    4.1 大鼠ClC-1的五個通道亞型的cDNA序列及氨基酸序列
        4.1.1 cDNA3'端的獲取
        4.1.2 cDNA近5'端片段的獲取
        4.1.3 cDNA中間片段的獲取
        4.1.4 片段的連接和大鼠ClC-1的5個通道亞型全長cDNA的獲取
        4.1.5 大鼠ClC-1的5個通道亞型的氨基酸序列特征
        4.1.6 cDNA的體外轉錄得到mRNA
    4.2 大鼠ClC-1五個通道亞型基因的表達和電生理特性
        4.2.1 M5的通道電流與離子選擇性
        4.2.2 M5的穩(wěn)態(tài)相對開放率對電壓和氯離子濃度的依賴性
        4.2.3 9-AC對M5的阻斷
        4.2.4 M5的通道電流對細胞外pH的依賴性
    4.3 大鼠WT ClC-1的通道電流與離子選擇性
    4.4 大鼠WT ClC-1對電壓和細胞外氯離子濃度的依賴性
    4.5 細胞外Ⅰ^-對大鼠WT ClC-1的阻斷
    4.6 9-AC對大鼠WT ClC-1的阻斷
    4.7 細胞外pH的變化對大鼠WT ClC-1的影響
        4.7.1 細胞外pH的變化對通道電流的影響
        4.7.2 細胞外pH的變化對通道相對開放率的影響
        4.7.3 細胞外Ⅰ^-在不同pH下的阻斷作用
        4.7.4 細胞外9-AC在不同pH下的阻斷作用
    4.8 通道亞型與大鼠WT ClC-1共同表達的通道的基本特性
    4.9 WT ClC-1門控機理模型的建立與分析
    4.10 通道電流長時間動態(tài)檢測和記錄軟件的設計
5 討論
    5.1 ClC-1組織分布及作用的多樣性
    5.2 ClC-1基因轉錄中剪接多樣性的機理
    5.3 ClC-1結構與功能關系的進一步揭示
    5.4 9-AC濃度依賴性阻斷機制的分析
    5.5 細胞外Ⅰ^-的濃度依賴性阻斷和離子選擇性原理
    5.6 ClC-1存在可滴定的電壓感受器
    5.7 ClC-1的非均衡性的門控機理
    5.8 結論和展望
參考文獻
已經(jīng)發(fā)表的論文目錄
致謝



本文編號：3822455