目的： 構(gòu)建DJ-1真核表達載體，篩選DJ-1穩(wěn)定高表達的H9c2心肌細胞系；在此基礎(chǔ)上，探討DJ-1高表達能否對抗模擬缺血再灌注（sI/R）所誘發(fā)的氧化應(yīng)激損傷，并進一步探求其可能的機制。 方法： 1.根據(jù)大鼠DJ-1基因序列（NM₀57143.1, CDS298~867），設(shè)計特異性克隆引物，提取大鼠心肌樣細胞系H9c2細胞總RNA，應(yīng)用RT-PCR方法獲取DJ-1全長cDNA，克隆至真核表達載體pFLAG-CMV-4，構(gòu)建DJ-1真核表達重組質(zhì)粒（pFLAG-CMV-4-DJ-1），應(yīng)用菌落PCR及DNA測序進行鑒定，確認后轉(zhuǎn)染H9c2細胞，經(jīng)G418選擇性培養(yǎng)篩選出兩株DJ-1穩(wěn)定高表達的H9c2細胞系（H9c2/DJ-1-A和H9c2/DJ-1-B），并通過Western blot測定穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞中DJ-1蛋白的表達而加以鑒定，同時篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pFLAG-CMV-4空載質(zhì)粒的H9c2細胞系（H9c2/Sham）作為對照用于后續(xù)細胞實驗； 2.各取未轉(zhuǎn)染的H9c2細胞、陰性對照的H9c2/Sham細胞、DJ-1高表達的H9c2/DJ... 

【文章頁數(shù)】：61 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
中英縮略詞表
第1章 引言
第2章 實驗材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 質(zhì)粒、菌株來源
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 實驗主要儀器和設(shè)備
    2.2 實驗方法與步驟
        2.2.1 主要試劑的配制
        2.2.2 細胞培養(yǎng)
        2.2.3 RT-PCR 方法克隆野生型 DJ-1 全長 cDNA 序列
        2.2.4 基因重組技術(shù)
        2.2.5 基因轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)
        2.2.6 建立 DJ-1 基因穩(wěn)定高表達的 H9c2 細胞系
        2.2.7 H9c2 細胞模擬缺血再灌注（sI/R）損傷模型的建立
        2.2.8 實驗設(shè)計及分組
        2.2.9 觀察指標及方法
    2.3 數(shù)據(jù)處理
第3章 結(jié)果
    3.1 DJ-1 真核表達質(zhì)粒構(gòu)建的結(jié)果
        3.1.1 RT-PCR 擴增大鼠 DJ-1 cDNA 的結(jié)果
        3.1.2 重組質(zhì)粒 pFLAG-CMV-4-DJ-1 的菌落 PCR 鑒定結(jié)果
        3.1.3 重組質(zhì)粒 pFLAG-CMV-4-DJ-1 的測序鑒定的結(jié)果
    3.2 DJ-1 基因穩(wěn)定高表達的 H9c2 細胞系的建立的結(jié)果
        3.2.1 H9c2 心肌樣細胞對 G418 的敏感性實驗結(jié)果
        3.2.2 穩(wěn)定篩選細胞中 DJ-1 蛋白表達的 Western blot 鑒定結(jié)果
    3.3 DJ-1 過表達對 H9c2 心肌細胞 sI/R 損傷的影響
    3.4 DJ-1 高表達對 sI/R 所誘發(fā)的氧化應(yīng)激的影響
    3.5 DJ-1 高表達對 H9c2 心肌細胞 sI/R 損傷后 ROS 生成的影響
    3.6 DJ-1 高表達對 H9c2 心肌細胞內(nèi)抗氧化酶活性的影響
    3.7 DJ-1 高表達對 H9c2 心肌細胞內(nèi)抗氧化酶 MnSOD、CAT 及 GPx 表達的影響
第4章 討論
第5章 結(jié)論與展望
    5.1 結(jié)論
    5.2 展望
致謝
參考文獻
攻讀學(xué)位期間的研究成果
綜述
    參考文獻



本文編號：3725230