目的： 構(gòu)建DJ-1真核表達(dá)載體，篩選DJ-1穩(wěn)定高表達(dá)的H9c2心肌細(xì)胞系；在此基礎(chǔ)上，探討DJ-1高表達(dá)能否對(duì)抗模擬缺血再灌注（sI/R）所誘發(fā)的氧化應(yīng)激損傷，并進(jìn)一步探求其可能的機(jī)制。 方法： 1.根據(jù)大鼠DJ-1基因序列（NM₀57143.1, CDS298~867），設(shè)計(jì)特異性克隆引物，提取大鼠心肌樣細(xì)胞系H9c2細(xì)胞總RNA，應(yīng)用RT-PCR方法獲取DJ-1全長(zhǎng)cDNA，克隆至真核表達(dá)載體pFLAG-CMV-4，構(gòu)建DJ-1真核表達(dá)重組質(zhì)粒（pFLAG-CMV-4-DJ-1），應(yīng)用菌落PCR及DNA測(cè)序進(jìn)行鑒定，確認(rèn)后轉(zhuǎn)染H9c2細(xì)胞，經(jīng)G418選擇性培養(yǎng)篩選出兩株DJ-1穩(wěn)定高表達(dá)的H9c2細(xì)胞系（H9c2/DJ-1-A和H9c2/DJ-1-B），并通過Western blot測(cè)定穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞中DJ-1蛋白的表達(dá)而加以鑒定，同時(shí)篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pFLAG-CMV-4空載質(zhì)粒的H9c2細(xì)胞系（H9c2/Sham）作為對(duì)照用于后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)； 2.各取未轉(zhuǎn)染的H9c2細(xì)胞、陰性對(duì)照的H9c2/Sham細(xì)胞、DJ-1高表達(dá)的H9c2/DJ... 

【文章頁數(shù)】：61 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
中英縮略詞表
第1章 引言
第2章 實(shí)驗(yàn)材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 質(zhì)粒、菌株來源
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 實(shí)驗(yàn)主要儀器和設(shè)備
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法與步驟
        2.2.1 主要試劑的配制
        2.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)
        2.2.3 RT-PCR 方法克隆野生型 DJ-1 全長(zhǎng) cDNA 序列
        2.2.4 基因重組技術(shù)
        2.2.5 基因轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)
        2.2.6 建立 DJ-1 基因穩(wěn)定高表達(dá)的 H9c2 細(xì)胞系
        2.2.7 H9c2 細(xì)胞模擬缺血再灌注（sI/R）損傷模型的建立
        2.2.8 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及分組
        2.2.9 觀察指標(biāo)及方法
    2.3 數(shù)據(jù)處理
第3章 結(jié)果
    3.1 DJ-1 真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建的結(jié)果
        3.1.1 RT-PCR 擴(kuò)增大鼠 DJ-1 cDNA 的結(jié)果
        3.1.2 重組質(zhì)粒 pFLAG-CMV-4-DJ-1 的菌落 PCR 鑒定結(jié)果
        3.1.3 重組質(zhì)粒 pFLAG-CMV-4-DJ-1 的測(cè)序鑒定的結(jié)果
    3.2 DJ-1 基因穩(wěn)定高表達(dá)的 H9c2 細(xì)胞系的建立的結(jié)果
        3.2.1 H9c2 心肌樣細(xì)胞對(duì) G418 的敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.2.2 穩(wěn)定篩選細(xì)胞中 DJ-1 蛋白表達(dá)的 Western blot 鑒定結(jié)果
    3.3 DJ-1 過表達(dá)對(duì) H9c2 心肌細(xì)胞 sI/R 損傷的影響
    3.4 DJ-1 高表達(dá)對(duì) sI/R 所誘發(fā)的氧化應(yīng)激的影響
    3.5 DJ-1 高表達(dá)對(duì) H9c2 心肌細(xì)胞 sI/R 損傷后 ROS 生成的影響
    3.6 DJ-1 高表達(dá)對(duì) H9c2 心肌細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性的影響
    3.7 DJ-1 高表達(dá)對(duì) H9c2 心肌細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶 MnSOD、CAT 及 GPx 表達(dá)的影響
第4章 討論
第5章 結(jié)論與展望
    5.1 結(jié)論
    5.2 展望
致謝
參考文獻(xiàn)
攻讀學(xué)位期間的研究成果
綜述
    參考文獻(xiàn)



本文編號(hào)：3725230