發(fā)布時間：2022-10-18 19:43

　　人β-防御素是近來年發(fā)現(xiàn)的具有廣譜抗菌活性并在機體抵御外來微生物入侵中起防御作用的一類陽離子抗菌肽。 本論文研究了使用基因工程技術重組表達可溶性人β-防御素的方法。以人β-防御素-2（HBD-2）為示例蛋白，建立了從獲得基因、載體構建，到表達體系選擇、表達優(yōu)化及放大，直至產物分離純化、生物活性測定等整套工藝，并將其應用于HBD-3及HBD-4的重組表達。 從人體炎癥皮膚組織（尖銳濕疣）中克隆獲得了HBD-2的人源基因，并對密碼子進行了分析及優(yōu)化，合成了無宿主稀有密碼子的基因。兩基因的對比表達實驗表明，合成基因的蛋白表達量約是人源基因表達量的9倍。 構建了多種HBD-2表達載體，分別在大腸桿菌、畢赤酵母菌及枯草芽孢桿菌3個表達系統(tǒng)中進行表達，經表達效果對比，選定了大腸桿菌系統(tǒng)的一個融合表達體系用于HBD-2的重組生產。 進行了大腸桿菌HBD-2融合表達體系的表達優(yōu)化及放大工作。通過對搖瓶表達條件的研究，獲得了如下的優(yōu)化培養(yǎng)條件：培養(yǎng)基為MBL，培養(yǎng)溫度為28℃，裝液量為12％（v／v）... 

【文章頁數(shù)】：126 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
目錄
摘要
ABSTRACT
前言
第一章 文獻綜述
    1.1 引言
    1.2 人防御素的組織分布
    1.3 人防御素的分子生物學特征
        1.3.1 分子結構
        1.3.2 基因結構及其定位
        1.3.3 基因的表達調控
        1.3.4 翻譯后修飾
    1.4 人防御素的抗菌活性及作用機理
        1.4.1 抗菌活性
        1.4.2 作用機理
    1.5 人防御素的醫(yī)學和藥用價值及前景展望
        1.5.1 醫(yī)學及藥用價值
        1.5.2 前景展望
    1.6 基因工程生產人防御素
        1.6.1 國內外研究進展
        1.6.2 表達系統(tǒng)的比較
        1.6.3 大腸桿菌中的融合表達體系
        1.6.4 大腸桿菌中表達可溶性外源蛋白
    1.7 小結
第二章 材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 質粒
        2.1.2 菌種
        2.1.3 抗體
        2.1.4 工具酶及試劑盒
        2.1.5 培養(yǎng)基
        2.1.6 主要儀器
    2.2 實驗及分析方法
        2.2.1 分子克隆相關實驗
        2.2.2 大腸桿菌菌體濃度測定
        2.2.3 大腸桿菌細胞超聲破碎及胞內蛋白提取
        2.2.4 蛋白濃度測定
        2.2.5 SDS-PAGE電泳
        2.2.6 Western Blotting分析
        2.2.7 還原糖濃度測定
第三章 人β-防御素-2的基因克隆、密碼子優(yōu)化及多拷貝串聯(lián)基因的構建
    3.1 引言
    3.2 材料與方法
        3.2.1 實驗材料
        3.2.2 實驗方法
    3.3 結果與討論
        3.3.1 逆轉錄-PCR
        3.3.2 密碼子優(yōu)化
        3.3.3 全基因合成
        3.3.4 克隆載體構建
        3.3.5 基因序列測定
        3.3.6 定點突變
        3.3.7 多拷貝串聯(lián)基因構建
        3.3.8 添加His-Tag
    3.4 小結
第四章 在大腸桿菌中表達人β-防御素-2
    4.1 引言
    4.2 材料與方法
        4.2.1 實驗材料
        4.2.2 實驗方法
    4.3 結果與討論
        4.3.1 HBD-2表達載體的構建及目標蛋白表達
        4.3.2 兩種基因(人源、合成)的比較
        4.3.3 串聯(lián)基因對重組菌生長及質粒穩(wěn)定性的影響
    4.4 小結
第五章 在畢赤酵母及枯草芽孢桿菌中表達人β-防御素-2
    5.1 引言
    5.2 材料與方法
        5.2.1 實驗材料
        5.2.2 實驗方法
    5.3 結果與討論
        5.3.1 在畢赤酵母中表達HBD-2
        5.3.2 在枯草芽孢桿菌中表達HBD-2
        5.3.3 三種宿主菌表達情況的比較
    5.4 小結
第六章 重組人β-防御素-2的表達優(yōu)化及放大
    6.1 引言
    6.2 材料與方法
        6.2.1 實驗材料
        6.2.2 實驗方法
    6.3 結果與討論
        6.3.1 培養(yǎng)基的選擇
        6.3.2 培養(yǎng)溫度的選擇
        6.3.3 裝液量的選擇
        6.3.4 誘導劑終濃度的選擇
        6.3.5 誘導時機的選擇
        6.3.6 表達時間的確定
        6.3.7 表達載體的改建
        6.3.8 表達的放大
        6.3.9 重組菌發(fā)酵的動力學研究
    6.4 小結
第七章 重組人β-防御素-2的分離純化
    7.1 引言
    7.2 材料與方法
        7.2.1 實驗材料
        7.2.2 實驗方法
    7.3 結果與討論
        7.3.1 親和層析分離融合蛋白
        7.3.2 腸激酶裂解融合蛋白
        7.3.3 陽離子交換層析分離重組HBD-2
        7.3.4 重組HBD-2的精制
        7.3.5 滲透沖擊法提取融合蛋白
        7.3.6 分離工藝總結
    7.4 小結
第八章 重組人β-防御素-2的活性測定
    8.1 引言
    8.2 材料與方法
        8.2.1 實驗材料
        8.2.2 實驗方法
    8.3 結果與討論
        8.3.1 固體平板擴散法
        8.3.2 液體培養(yǎng)法測定抑菌活性
        8.3.3 抑菌效果與培養(yǎng)時間的關系
        8.3.4 抑菌效果與NaCl濃度的關系
    8.4 小結
第九章 在大腸桿菌中表達人β-防御素-3，4
    9.1 引言
    9.2 材料與方法
        9.2.1 實驗材料
        9.2.2 實驗方法
    9.3 結果與討論
        9.3.1 密碼子優(yōu)化
        9.3.2 全基因合成
        9.3.3 表達載體的構建
        9.3.4 重組目標蛋白表達
    9.4 小結
結論
致謝
論文發(fā)表情況


【參考文獻】：
期刊論文
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本文編號：3692935