人β-防御素是近來年發(fā)現(xiàn)的具有廣譜抗菌活性并在機(jī)體抵御外來微生物入侵中起防御作用的一類陽離子抗菌肽。 本論文研究了使用基因工程技術(shù)重組表達(dá)可溶性人β-防御素的方法。以人β-防御素-2（HBD-2）為示例蛋白，建立了從獲得基因、載體構(gòu)建，到表達(dá)體系選擇、表達(dá)優(yōu)化及放大，直至產(chǎn)物分離純化、生物活性測定等整套工藝，并將其應(yīng)用于HBD-3及HBD-4的重組表達(dá)。 從人體炎癥皮膚組織（尖銳濕疣）中克隆獲得了HBD-2的人源基因，并對密碼子進(jìn)行了分析及優(yōu)化，合成了無宿主稀有密碼子的基因。兩基因的對比表達(dá)實(shí)驗(yàn)表明，合成基因的蛋白表達(dá)量約是人源基因表達(dá)量的9倍。 構(gòu)建了多種HBD-2表達(dá)載體，分別在大腸桿菌、畢赤酵母菌及枯草芽孢桿菌3個(gè)表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)，經(jīng)表達(dá)效果對比，選定了大腸桿菌系統(tǒng)的一個(gè)融合表達(dá)體系用于HBD-2的重組生產(chǎn)。 進(jìn)行了大腸桿菌HBD-2融合表達(dá)體系的表達(dá)優(yōu)化及放大工作。通過對搖瓶表達(dá)條件的研究，獲得了如下的優(yōu)化培養(yǎng)條件：培養(yǎng)基為MBL，培養(yǎng)溫度為28℃，裝液量為12％（v／v）... 

【文章頁數(shù)】：126 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
目錄
摘要
ABSTRACT
前言
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 引言
    1.2 人防御素的組織分布
    1.3 人防御素的分子生物學(xué)特征
        1.3.1 分子結(jié)構(gòu)
        1.3.2 基因結(jié)構(gòu)及其定位
        1.3.3 基因的表達(dá)調(diào)控
        1.3.4 翻譯后修飾
    1.4 人防御素的抗菌活性及作用機(jī)理
        1.4.1 抗菌活性
        1.4.2 作用機(jī)理
    1.5 人防御素的醫(yī)學(xué)和藥用價(jià)值及前景展望
        1.5.1 醫(yī)學(xué)及藥用價(jià)值
        1.5.2 前景展望
    1.6 基因工程生產(chǎn)人防御素
        1.6.1 國內(nèi)外研究進(jìn)展
        1.6.2 表達(dá)系統(tǒng)的比較
        1.6.3 大腸桿菌中的融合表達(dá)體系
        1.6.4 大腸桿菌中表達(dá)可溶性外源蛋白
    1.7 小結(jié)
第二章 材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 質(zhì)粒
        2.1.2 菌種
        2.1.3 抗體
        2.1.4 工具酶及試劑盒
        2.1.5 培養(yǎng)基
        2.1.6 主要儀器
    2.2 實(shí)驗(yàn)及分析方法
        2.2.1 分子克隆相關(guān)實(shí)驗(yàn)
        2.2.2 大腸桿菌菌體濃度測定
        2.2.3 大腸桿菌細(xì)胞超聲破碎及胞內(nèi)蛋白提取
        2.2.4 蛋白濃度測定
        2.2.5 SDS-PAGE電泳
        2.2.6 Western Blotting分析
        2.2.7 還原糖濃度測定
第三章 人β-防御素-2的基因克隆、密碼子優(yōu)化及多拷貝串聯(lián)基因的構(gòu)建
    3.1 引言
    3.2 材料與方法
        3.2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.2.2 實(shí)驗(yàn)方法
    3.3 結(jié)果與討論
        3.3.1 逆轉(zhuǎn)錄-PCR
        3.3.2 密碼子優(yōu)化
        3.3.3 全基因合成
        3.3.4 克隆載體構(gòu)建
        3.3.5 基因序列測定
        3.3.6 定點(diǎn)突變
        3.3.7 多拷貝串聯(lián)基因構(gòu)建
        3.3.8 添加His-Tag
    3.4 小結(jié)
第四章 在大腸桿菌中表達(dá)人β-防御素-2
    4.1 引言
    4.2 材料與方法
        4.2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.2.2 實(shí)驗(yàn)方法
    4.3 結(jié)果與討論
        4.3.1 HBD-2表達(dá)載體的構(gòu)建及目標(biāo)蛋白表達(dá)
        4.3.2 兩種基因(人源、合成)的比較
        4.3.3 串聯(lián)基因?qū)χ亟M菌生長及質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響
    4.4 小結(jié)
第五章 在畢赤酵母及枯草芽孢桿菌中表達(dá)人β-防御素-2
    5.1 引言
    5.2 材料與方法
        5.2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        5.2.2 實(shí)驗(yàn)方法
    5.3 結(jié)果與討論
        5.3.1 在畢赤酵母中表達(dá)HBD-2
        5.3.2 在枯草芽孢桿菌中表達(dá)HBD-2
        5.3.3 三種宿主菌表達(dá)情況的比較
    5.4 小結(jié)
第六章 重組人β-防御素-2的表達(dá)優(yōu)化及放大
    6.1 引言
    6.2 材料與方法
        6.2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        6.2.2 實(shí)驗(yàn)方法
    6.3 結(jié)果與討論
        6.3.1 培養(yǎng)基的選擇
        6.3.2 培養(yǎng)溫度的選擇
        6.3.3 裝液量的選擇
        6.3.4 誘導(dǎo)劑終濃度的選擇
        6.3.5 誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的選擇
        6.3.6 表達(dá)時(shí)間的確定
        6.3.7 表達(dá)載體的改建
        6.3.8 表達(dá)的放大
        6.3.9 重組菌發(fā)酵的動(dòng)力學(xué)研究
    6.4 小結(jié)
第七章 重組人β-防御素-2的分離純化
    7.1 引言
    7.2 材料與方法
        7.2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        7.2.2 實(shí)驗(yàn)方法
    7.3 結(jié)果與討論
        7.3.1 親和層析分離融合蛋白
        7.3.2 腸激酶裂解融合蛋白
        7.3.3 陽離子交換層析分離重組HBD-2
        7.3.4 重組HBD-2的精制
        7.3.5 滲透沖擊法提取融合蛋白
        7.3.6 分離工藝總結(jié)
    7.4 小結(jié)
第八章 重組人β-防御素-2的活性測定
    8.1 引言
    8.2 材料與方法
        8.2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        8.2.2 實(shí)驗(yàn)方法
    8.3 結(jié)果與討論
        8.3.1 固體平板擴(kuò)散法
        8.3.2 液體培養(yǎng)法測定抑菌活性
        8.3.3 抑菌效果與培養(yǎng)時(shí)間的關(guān)系
        8.3.4 抑菌效果與NaCl濃度的關(guān)系
    8.4 小結(jié)
第九章 在大腸桿菌中表達(dá)人β-防御素-3，4
    9.1 引言
    9.2 材料與方法
        9.2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        9.2.2 實(shí)驗(yàn)方法
    9.3 結(jié)果與討論
        9.3.1 密碼子優(yōu)化
        9.3.2 全基因合成
        9.3.3 表達(dá)載體的構(gòu)建
        9.3.4 重組目標(biāo)蛋白表達(dá)
    9.4 小結(jié)
結(jié)論
致謝
論文發(fā)表情況


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號：3692935