通用H5N1亞型禽流感病毒樣顆粒疫苗的制備
發(fā)布時(shí)間：2021-10-21 23:55
目的高致病性H5N1亞型流感病毒可感染人,并不斷衍生出多個(gè)新的基因譜系,存在著大規(guī)模流行的可能性。我國現(xiàn)有的商品化疫苗無法對不同譜系的H5N1流感病毒感染提供有效的保護(hù)。病毒樣顆粒（Virus-like particles,VLPs）疫苗具有良好的免疫原性和安全性,成為近年研究的熱點(diǎn)。本研究旨在建立H5亞型禽流感病毒通用型病毒樣顆粒疫苗的制備方法。方法將優(yōu)化的H5N1 A/meerkat/Shanghai/SH-1/2012（clade 2.3.2.1）亞型流感病毒的HLHA（HA stem）/5M2e（5個(gè)M2e）/HL5M2e（5M2e替代HA的頭部嵌入HLHA）、NP基因和M1基因分別插入pFastBacDual載體,得到相應(yīng)的重組供體。然后將重組供體轉(zhuǎn)化至含Bacmid的DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞中,獲得含有目的基因的重組桿粒。結(jié)果酶切和PCR鑒定表明成功構(gòu)建了含目的基因的重組桿粒Bacmid-（HLHA/5M2e/HL5M2e、NP、M1）。將重組桿粒轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞,IFA試驗(yàn)和Western blot試驗(yàn)皆證實(shí),優(yōu)化的HLHA（HA stem）/5M2e/HL5M2e、N...
【文章來源】：中國病原生物學(xué)雜志. 2019,14(07)北大核心CSCD
【文章頁數(shù)】：6 頁
【部分圖文】：
圖２ｐＦａｓｔＢａｃｄｕａｌ重組質(zhì)粒雙酶切鑒定Ａ１、２ＦａｓｔＢａｃ－Ｄｕａｌ－２ＨＬＨＡ（１０２３ｂｐ）
、９ｐＦａｓｔＢａｃ－Ｄｕａｌ－２５Ｍ２ｅ１０ｐＦａｓｔＢａｃ－Ｄｕａｌ－２Ｍ１Ｆｉｇ．３ＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＢａｃｍｉｄｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄ４重組桿粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞病變情況將拯救出的重組桿狀病毒傳至第２代時(shí)，正常細(xì)胞（圖４Ａ）即出現(xiàn)明顯病變。Ｓｆ９細(xì)胞在接毒１２ｈ后，單個(gè)細(xì)胞開始變大變圓，細(xì)胞內(nèi)部有顆粒狀的病變物質(zhì)產(chǎn)生（圖４Ｂ）。待細(xì)胞培養(yǎng)至９６ｈ，細(xì)胞懸浮很嚴(yán)重，幾乎全部脫落（圖４Ｃ）。圖４Ｓｆ９細(xì)胞病變過程Ｆｉｇ．４Ｓｆ９ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃｐｒｏｃｅｓｓ５間接免疫熒光試驗(yàn)檢測到目的蛋白的表達(dá)間接免疫熒光試驗(yàn)顯示，空桿狀病毒轉(zhuǎn)染Ｓｆ９細(xì)胞（圖５Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｊ）為陰性，重組桿狀病毒ｒｐＦａｓｔ－Ｂａｃ－２ＨＬＨＡ（圖５Ａ）、ｒｐＦａｓｔＢａｃ－２５Ｍ２ｅ（圖５Ｃ）、ｒｐ－ＦａｓｔＢａｃ－２ＨＬ５Ｍ２ｅ（圖５Ｅ）、ｒｐＦａｓｔＢａｃ－２ＮＰ（圖５Ｇ）和ｒｐＦａｓｔＢａｃ－２Ｍ１（圖５Ｉ）轉(zhuǎn)染Ｓｆ９細(xì)胞均出現(xiàn)綠色熒光，表明重組桿狀病毒表達(dá)目的蛋白ＨＬＨＡ、５Ｍ２ｅ、ＨＬ５Ｍ２ｅ、ＮＰ和Ｍ１。·５７８·中國病原生物學(xué)雜志ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰａｔｈｏｇｅｎＢｉｏｌｏｇｙ２０１９年７月第１４卷第７期Ｊｕｌ．２０１９，Ｖｏｌ．１４，Ｎｏ．７
圖５目的蛋白間接免疫熒光檢測Ｆｉｇ．５Ｉｎｄｉｒｅｃｔｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅａｓｓａｙ６Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ檢測目的蛋白的表達(dá)分別用抗Ｈ５Ｎ１Ａ／ｍｅｅｒｋａｔ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／ＳＨ－１／２０１２（ＳＨ－１）雞血清，抗ＮＰ蛋白鼠單克隆抗體，及抗Ｍ１蛋白兔多克隆抗體為一抗對ＡＩＶＶＬＰｓ進(jìn)行Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鑒定分析，結(jié)果見圖６，目的蛋白均被相應(yīng)抗體識別，表明ＡＩＶ的結(jié)構(gòu)蛋白成功組裝了ＡＩＶＶＬＰｓ。圖６Ｈ５Ｎ１ＶＬＰｓ的Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鑒定Ｆｉｇ．６ＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔａｓｓａｙｓｏｆＨ５Ｎ１ＶＬＰｓ７透射電子顯微鏡觀察ＶＬＰｓ形態(tài)將純化的３種ＡＩＶＶＬＰｓ在透射電鏡下觀察，可觀察到球形結(jié)構(gòu)和１００ｎｍ左右與天然流感病毒形態(tài)相近的ＡＩＶＶＬＰｓ（圖７）。圖７病毒樣顆粒形態(tài)（４０００×）Ｆｉｇ．７Ｖｉｒｕｓ－ｌｉｋｅｐａｒｔｉｃｌｅｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ（４０００×）討論自２００３年起，高致病性Ｈ５Ｎ１亞型流感病毒感染人的事件不斷發(fā)生，并且不斷衍生出多個(gè)新的基因譜系，存在大規(guī)模流行的可能性，因此亟待研制出一種安全有效的能夠保護(hù)Ｈ５Ｎ１亞型流感病毒不同譜系的通用型疫苗［１２－１３］。病毒樣顆粒疫苗作為一種新興的疫苗，具有良好的安全性和免疫原性［１４］。在有囊膜和無囊膜的情況下，病毒樣顆粒均能刺激機(jī)體產(chǎn)生體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)。用昆蟲細(xì)胞生產(chǎn)流感疫苗可彌補(bǔ)依賴雞胚生產(chǎn)流感疫苗的很多缺陷，具有可觀的開發(fā)與應(yīng)用前
【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]H9N2禽流感病毒血凝素蛋白的主要特性及B/T細(xì)胞抗原表位預(yù)測分析[J]. 于娟,李紅,饒華祥,盧囡囡,雷有菊,趙生倉. 中國病原生物學(xué)雜志. 2018(01)
本文編號：3449968
【文章來源】：中國病原生物學(xué)雜志. 2019,14(07)北大核心CSCD
【文章頁數(shù)】：6 頁
【部分圖文】：
圖２ｐＦａｓｔＢａｃｄｕａｌ重組質(zhì)粒雙酶切鑒定Ａ１、２ＦａｓｔＢａｃ－Ｄｕａｌ－２ＨＬＨＡ（１０２３ｂｐ）
、９ｐＦａｓｔＢａｃ－Ｄｕａｌ－２５Ｍ２ｅ１０ｐＦａｓｔＢａｃ－Ｄｕａｌ－２Ｍ１Ｆｉｇ．３ＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＢａｃｍｉｄｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄ４重組桿粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞病變情況將拯救出的重組桿狀病毒傳至第２代時(shí)，正常細(xì)胞（圖４Ａ）即出現(xiàn)明顯病變。Ｓｆ９細(xì)胞在接毒１２ｈ后，單個(gè)細(xì)胞開始變大變圓，細(xì)胞內(nèi)部有顆粒狀的病變物質(zhì)產(chǎn)生（圖４Ｂ）。待細(xì)胞培養(yǎng)至９６ｈ，細(xì)胞懸浮很嚴(yán)重，幾乎全部脫落（圖４Ｃ）。圖４Ｓｆ９細(xì)胞病變過程Ｆｉｇ．４Ｓｆ９ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃｐｒｏｃｅｓｓ５間接免疫熒光試驗(yàn)檢測到目的蛋白的表達(dá)間接免疫熒光試驗(yàn)顯示，空桿狀病毒轉(zhuǎn)染Ｓｆ９細(xì)胞（圖５Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｊ）為陰性，重組桿狀病毒ｒｐＦａｓｔ－Ｂａｃ－２ＨＬＨＡ（圖５Ａ）、ｒｐＦａｓｔＢａｃ－２５Ｍ２ｅ（圖５Ｃ）、ｒｐ－ＦａｓｔＢａｃ－２ＨＬ５Ｍ２ｅ（圖５Ｅ）、ｒｐＦａｓｔＢａｃ－２ＮＰ（圖５Ｇ）和ｒｐＦａｓｔＢａｃ－２Ｍ１（圖５Ｉ）轉(zhuǎn)染Ｓｆ９細(xì)胞均出現(xiàn)綠色熒光，表明重組桿狀病毒表達(dá)目的蛋白ＨＬＨＡ、５Ｍ２ｅ、ＨＬ５Ｍ２ｅ、ＮＰ和Ｍ１。·５７８·中國病原生物學(xué)雜志ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰａｔｈｏｇｅｎＢｉｏｌｏｇｙ２０１９年７月第１４卷第７期Ｊｕｌ．２０１９，Ｖｏｌ．１４，Ｎｏ．７
圖５目的蛋白間接免疫熒光檢測Ｆｉｇ．５Ｉｎｄｉｒｅｃｔｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅａｓｓａｙ６Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ檢測目的蛋白的表達(dá)分別用抗Ｈ５Ｎ１Ａ／ｍｅｅｒｋａｔ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／ＳＨ－１／２０１２（ＳＨ－１）雞血清，抗ＮＰ蛋白鼠單克隆抗體，及抗Ｍ１蛋白兔多克隆抗體為一抗對ＡＩＶＶＬＰｓ進(jìn)行Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鑒定分析，結(jié)果見圖６，目的蛋白均被相應(yīng)抗體識別，表明ＡＩＶ的結(jié)構(gòu)蛋白成功組裝了ＡＩＶＶＬＰｓ。圖６Ｈ５Ｎ１ＶＬＰｓ的Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鑒定Ｆｉｇ．６ＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔａｓｓａｙｓｏｆＨ５Ｎ１ＶＬＰｓ７透射電子顯微鏡觀察ＶＬＰｓ形態(tài)將純化的３種ＡＩＶＶＬＰｓ在透射電鏡下觀察，可觀察到球形結(jié)構(gòu)和１００ｎｍ左右與天然流感病毒形態(tài)相近的ＡＩＶＶＬＰｓ（圖７）。圖７病毒樣顆粒形態(tài)（４０００×）Ｆｉｇ．７Ｖｉｒｕｓ－ｌｉｋｅｐａｒｔｉｃｌｅｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ（４０００×）討論自２００３年起，高致病性Ｈ５Ｎ１亞型流感病毒感染人的事件不斷發(fā)生，并且不斷衍生出多個(gè)新的基因譜系，存在大規(guī)模流行的可能性，因此亟待研制出一種安全有效的能夠保護(hù)Ｈ５Ｎ１亞型流感病毒不同譜系的通用型疫苗［１２－１３］。病毒樣顆粒疫苗作為一種新興的疫苗，具有良好的安全性和免疫原性［１４］。在有囊膜和無囊膜的情況下，病毒樣顆粒均能刺激機(jī)體產(chǎn)生體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)。用昆蟲細(xì)胞生產(chǎn)流感疫苗可彌補(bǔ)依賴雞胚生產(chǎn)流感疫苗的很多缺陷，具有可觀的開發(fā)與應(yīng)用前
【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]H9N2禽流感病毒血凝素蛋白的主要特性及B/T細(xì)胞抗原表位預(yù)測分析[J]. 于娟,李紅,饒華祥,盧囡囡,雷有菊,趙生倉. 中國病原生物學(xué)雜志. 2018(01)
本文編號：3449968
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