目的構(gòu)建乙型腦炎病毒野毒株SA14包膜蛋白K279M突變株感染性克隆并拯救病毒,探索K279M突變對(duì)其毒力的影響。方法應(yīng)用重疊延伸PCR和分子克隆技術(shù)構(gòu)建含有K279M突變的乙腦突變病毒全長(zhǎng)cDNA質(zhì)粒,經(jīng)酶切鑒定后,以其為模板體外轉(zhuǎn)錄獲得RNA,電轉(zhuǎn)染BHK21細(xì)胞,得到恢復(fù)病毒JEV SA14 （K279M）。分別用野毒株JEV SA14和JEV SA14 （K279M）接種BHK21細(xì)胞和腦內(nèi)接種昆明鼠,比較突變株與野毒株的蝕斑大小、生長(zhǎng)特點(diǎn)以及對(duì)昆明鼠的神經(jīng)毒力。結(jié)果酶切鑒定表明,突變病毒感染性克隆成功構(gòu)建。病毒蝕斑試驗(yàn)顯示,JEV SA14 （K279M）的蝕斑直徑約為2～3 mm,大于野毒株蝕斑直徑的1～2 mm。突變株病毒LD50為0.21PFU,大于野毒株病毒LD₅₀的0.05PFU。結(jié)論乙腦包膜蛋白K279M突變?cè)龃罅瞬《镜奈g斑,但降低了病毒的腦內(nèi)神經(jīng)毒力。 

【文章來(lái)源】：中國(guó)病原生物學(xué)雜志. 2019,14(09)北大核心CSCD

【文章頁(yè)數(shù)】：5 頁(yè)

【部分圖文】：

圖１重疊延伸ＰＣＲ擴(kuò)增含２７９突變ＤＮＡ片段示意圖Ｆｉｇ．１ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｆｌｏｗｃｈａｒｔｏｆＫ２７９ＭｍｕｔａｔｅｄＤＮＡｆｒａｇｍｅｎｔｓｂｙＯｖｅｒｌａｐｐｉｎｇＰＣＲ

２條片段，其中ＡｓｃＩ＋ＫａｓＩ雙酶切得到約０．５和５．６ｋｂ２條片段；ＫａｓＩ＋ＢｇｌＩＩ雙酶切得到約２．２ｋｂ和３．９ｋｂ２條片段；ＢｇｌＩＩ＋ＢｓｐＥＩ雙酶切得到約０．８和５．３ｋｂ２條片段（圖４），與理論值相符。Ｍ１ＤＮＡ標(biāo)志物（ＤＬ１５０００）Ｍ２ＤＮＡ標(biāo)志物（ＤＬ２０００）１引物Ｆ２和Ｅ２７９Ｒ配對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物２引物Ｅ２７９Ｆ和Ｒ３配對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物３引物Ｆ２和Ｒ３配對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物圖３含Ｅ２７９突變ｐｒＭ／Ｅ重疊延伸ＰＣＲ擴(kuò)增產(chǎn)物Ｍ１ＤＮＡｍａｒｋｅｒ（ＤＬ１５０００）Ｍ２ＤＮＡｍａｒｋｅｒ（ＤＬ２０００）１ＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆｐｒｉｍｅｒＦ２ａｎｄＥ２７９Ｒ２ＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆｐｒｉｍｅｒＥ２７９ＦａｎｄＲ３３ＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆｐｒｉｍｅｒＦ２ａｎｄＲ３Ｆｉｇ．３ＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｓｂｙＯｖｅｒｌａｐｐｉｎｇＰＣＲ·３０１１·中國(guó)病原生物學(xué)雜志ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰａｔｈｏｇｅｎＢｉｏｌｏｇｙ２０１９年９月第１４卷第９期Ｓｅｐ．２０１９，Ｖｏｌ．１４，Ｎｏ．９

Ｍ１ＤＮＡ標(biāo)志物（ＤＬ１５０００）１ｐＡＣＮＲ－ＪＥＶＳＡ１４（Ｋ２７９Ｍ）－５＇２ｐＡＣＮＲ－ＪＥＶＳＡ１４（Ｋ２７９Ｍ）－５＇／ＡｓｃＩ＋ＫａｓＩ３ｐＡＣＮＲ－ＪＥＶＳＡ１４（Ｋ２７９Ｍ）－５＇／ＫａｓＩ＋ＢｇｌＩＩ４ｐＡＣＮＲ－ＪＥＶＳＡ１４（Ｋ２７９Ｍ）－５＇／ＢｇｌＩＩ＋ＢｓｐＥＩＭ２ＤＮＡ標(biāo)志物（ＤＬ２０００）圖４ｐＡＣＮＲ－ＪＥＶＳＡ１４（Ｋ２７９Ｍ）－５＇酶切鑒定Ｍ１ＤＮＡ－ｍａｒｋｅｒ（ＤＬ１５０００）１ｐＡＣＮＲ－ＪＥＶ－ＳＡ１４（Ｋ２７９Ｍ）－５＇２ｐＡＣＮＲ－ＪＥＶ－ＳＡ１４（Ｋ２７９Ｍ）－５＇／ＡｓｃＩ＋ＫａｓＩ３ｐＡＣＮＲ－ＪＥＶ－ＳＡ１４（Ｋ２７９Ｍ）－５＇／ＫａｓＩ＋ＢｇｌＩＩ４ｐＡＣＮＲ－ＪＥＶ－ＳＡ１４（Ｋ２７９Ｍ）－５＇／ＢｇｌＩＩ＋ＢｓｐＥＩＭ２ＤＮＡｍａｒｋｅｒ（ＤＬ２０００）Ｆｉｇ．４ＲｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｐＡＣＮＲ－ＪＥＶＳＡ１４（Ｋ２７９Ｍ）－５＇３全長(zhǎng)質(zhì)粒ｐＡＣＮＲ－ＪＥＶＳＡ１４（Ｋ２７９Ｍ）的酶切鑒定用限制性內(nèi)切酶酶切ｐＡＣＮＲ－ＪＥＶＳＡ１４（Ｋ２７９Ｍ）全長(zhǎng)質(zhì)粒并進(jìn)行１％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖５。其中經(jīng)ＢａｍＨＩ單酶切片段約１３．６ｋｂ，ＢｓｐＥＩ＋Ｘｈｏｌ雙酶切片段約７．５和６．１ｋｂ，ＢｇｌＩＩ單酶切片段約５．０、４．０、３．０、１．２ｋｂ，與理論值相符。Ｍ１ＤＮＡ標(biāo)志物（ＤＬ１５０００）１ｐＡＣＮＲ－ＪＥＶＳＡ１４（Ｋ２７９Ｍ）／ＢａｍＨＩ２ｐＡＣＮＲ－ＪＥＶＳＡ１

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]乙腦病毒野毒株SA14感染性克隆的構(gòu)建及病毒拯救[J]. 冷生玲,黃榮,馮亞嵐,唐麗萍,周仲輝,陳大斌,楊健.  中國(guó)病原生物學(xué)雜志. 2018(09)
[2]2012-2016年貴州省流行性乙型腦炎實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測(cè)病例特征分析[J]. 趙蘇曄,葉緒芳,劉淳婷,劉銘.  中國(guó)病原生物學(xué)雜志. 2018(04)
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