目的:構(gòu)建重組RPLP0蛋白的原核表達(dá)載體并誘導(dǎo)表達(dá),對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化鑒定及評(píng)價(jià)。方法:設(shè)計(jì)重組RPLP0蛋白基因,經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得目的基因;在其5′和3′端引入BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn),構(gòu)建pET41a-GST-RPLP0-6*His融合基因表達(dá)載體;對(duì)該質(zhì)粒載體進(jìn)行酶切鑒定和測(cè)序驗(yàn)證,將鑒定正確的重組質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌并以IPTG誘導(dǎo)表達(dá);經(jīng)過尿素溶液純化及復(fù)性以后得到復(fù)性的重組RPLP0蛋白;采用Western blot分析重組RPLP0蛋白的免疫原性;采用ELISA法對(duì)其抗體結(jié)合性、特異性進(jìn)行分析。結(jié)果:酶切及測(cè)序結(jié)果顯示,本實(shí)驗(yàn)成功克隆出重組RPLP0蛋白基因,將獲得的目的基因構(gòu)建至原核表達(dá)載體pET41a,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后成功表達(dá)目的蛋白。SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示重組RPLP0蛋白為包涵體表達(dá)蛋白,分子量約為61 kD。Western blot檢測(cè)顯示重組RPLP0蛋白具有完全的免疫原性;ELISA檢測(cè)顯示重組RPLP0蛋白具有良好的抗體結(jié)合性和特異性。結(jié)論:表達(dá)、鑒定并分析了重組RPLP0蛋白,為深入研究RPLP0蛋白的功能及應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 

【文章來源】：中國(guó)免疫學(xué)雜志. 2019,35(15)北大核心

【文章頁數(shù)】：5 頁

【部分圖文】：

重組RPLP0蛋白的基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與質(zhì)粒鑒定電泳圖

蛋白的表達(dá)、純化及復(fù)性的SDS-PAGE電泳圖Fig．2Expression，purificationandrenaturationofrecom-binantRPLP0proteinNote:A.ExpressionofrecombinantRPLP0protein(M.Marker，1.Liquidsupernatant，2.Inclusionbodies);B.Purificationofre-combinantRPLP0protein(M.Marker，1.Inclusionbodyeluent，2.2mol/Lureasolution，3.8mol/Lureasolution);C.RenaturationofrecombinantRPLP0protein(M.Marker，1.Refoldingsupernatant，2.Refoldingprecipitation).圖3重組RPLP0蛋白的免疫原性分析Fig．3ImmunogenicityofrecombinantRPLP0proteinNote:1.20ngRPLP0(Diarect);2.10ngRPLP0(Diarect);3.5ngRPLP0(Diarect).圖4兩種RPLP0蛋白檢測(cè)血清抗核糖體P蛋白抗體的相關(guān)性分析Fig．4Correlationanalysisofserumanti-ribosomalphos-phoproteinwhichwasdetectedbytwokindsofRPLP0protein表1重組RPLP0蛋白與常見自身抗體交叉反應(yīng)情況Tab．1SpecificityofrecombinantRPLP0proteinAutoantibodiesnLIAELISA(S/CO*)U1-nRNP63+0.61SmD163+0.53SS-A63+0.51SS-B63+0.31Scl-7063+0.26PM-Scl63+0.49Jo-163+0.53CENP-B63+0.43PCNA61+～2+0.55dsDNA62+～3+0.61NUC63+0.38AMAM263+0.39Note:S/CO*wasthemeanoftestforsamples．2.6重組RPLP0蛋白的抗體結(jié)合性分析如圖4所示，以Diarect公司的RPLP0蛋白包被酶標(biāo)板，檢測(cè)患者血清中抗核糖體P蛋白抗體的OD值為因變量(x);以復(fù)性的重組RPLP0蛋白包被酶標(biāo)板，檢測(cè)患者血清中抗核糖體P蛋白抗體的OD值為自變量(y);進(jìn)

er，1.Liquidsupernatant，2.Inclusionbodies);B.Purificationofre-combinantRPLP0protein(M.Marker，1.Inclusionbodyeluent，2.2mol/Lureasolution，3.8mol/Lureasolution);C.RenaturationofrecombinantRPLP0protein(M.Marker，1.Refoldingsupernatant，2.Refoldingprecipitation).圖3重組RPLP0蛋白的免疫原性分析Fig．3ImmunogenicityofrecombinantRPLP0proteinNote:1.20ngRPLP0(Diarect);2.10ngRPLP0(Diarect);3.5ngRPLP0(Diarect).圖4兩種RPLP0蛋白檢測(cè)血清抗核糖體P蛋白抗體的相關(guān)性分析Fig．4Correlationanalysisofserumanti-ribosomalphos-phoproteinwhichwasdetectedbytwokindsofRPLP0protein表1重組RPLP0蛋白與常見自身抗體交叉反應(yīng)情況Tab．1SpecificityofrecombinantRPLP0proteinAutoantibodiesnLIAELISA(S/CO*)U1-nRNP63+0.61SmD163+0.53SS-A63+0.51SS-B63+0.31Scl-7063+0.26PM-Scl63+0.49Jo-163+0.53CENP-B63+0.43PCNA61+～2+0.55dsDNA62+～3+0.61NUC63+0.38AMAM263+0.39Note:S/CO*wasthemeanoftestforsamples．2.6重組RPLP0蛋白的抗體結(jié)合性分析如圖4所示，以Diarect公司的RPLP0蛋白包被酶標(biāo)板，檢測(cè)患者血清中抗核糖體P蛋白抗體的OD值為因變量(x);以復(fù)性的重組RPLP0蛋白包被酶標(biāo)板，檢測(cè)患者血清中抗核糖體P蛋白抗體的OD值為自變量(y);進(jìn)行一元線性回歸分析發(fā)現(xiàn)，重組RPLP0蛋白包被酶標(biāo)板檢測(cè)血清抗核糖體P蛋白抗體的OD值與Diarect公司的RPLP0存在線性關(guān)系(F=6175.000，P＜0.0001)，一元線性回歸方程?

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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