研究目的：本研究利用抗葉酸代謝藥培美曲塞（PMX）對(duì)C57BL/6J孕鼠進(jìn)行藥物干預(yù),通過對(duì)孕鼠胚胎形態(tài)學(xué)觀察及其他指標(biāo)的檢測(cè),篩選出最佳的給藥劑量和時(shí)間,建立葉酸代謝障礙的C57BL/6J小鼠胚胎神經(jīng)管畸形（neural tube defects, NTDs）動(dòng)物模型；采用微陣列比較基因組雜交技術(shù)（aCGH）檢測(cè)PMX誘導(dǎo)NTDs模型基因組拷貝數(shù)變異；應(yīng)用全基因組表達(dá)譜芯片技術(shù)檢測(cè)PMX誘導(dǎo)NTDs模型的基因表達(dá)譜,篩選可能的PMX引起NTDs的致病基因；初步探討PMX對(duì)NTDs發(fā)生發(fā)展的影響及相關(guān)發(fā)病機(jī)制的研究。研究方法：本研究中將7-8周健康雌性C57BL/6J小鼠隨機(jī)分兩組受孕,給藥實(shí)驗(yàn)組于孕7.5（E7.5）天腹腔注射PMX,摸索適當(dāng)?shù)慕o藥劑量并建立神經(jīng)管畸形動(dòng)物模型,正常對(duì)照組按體重注射同等劑量的生理鹽水。在孕11.5（E11.5）天,頸椎離斷處死實(shí)驗(yàn)組和正常對(duì)照組孕鼠,取胚胎于在解剖顯微鏡下觀察胚胎神經(jīng)管畸形的外部特征；經(jīng)固定、切片、染色后,光鏡下觀察畸胎情況及神經(jīng)管形態(tài)改變；高效液相色譜法首先測(cè)定PMX干預(yù)孕鼠的不同時(shí)間點(diǎn)的葉酸及代謝產(chǎn)物水平；ELISA方法檢測(cè)PMX誘... 

【文章來源】：山西醫(yī)科大學(xué)山西省

【文章頁(yè)數(shù)】：110 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮寫對(duì)照表
前言
第一部分 培美曲塞誘導(dǎo)神經(jīng)管畸形小鼠模型的建立
    1 前言
    2 材料
        2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來源及飼養(yǎng)
        2.2 實(shí)驗(yàn)試劑
        2.3 實(shí)驗(yàn)器材
        2.4 溶液配制
    3. 方法
        3.1 神經(jīng)管畸形動(dòng)物模型的建立
        3.2 取材
        3.3 組織病理檢測(cè)
        3.4 數(shù)據(jù)分析
    4. 結(jié)果
    5. 討論
第二部分 PMX誘導(dǎo)神經(jīng)管畸形小鼠胚胎中葉酸及其代謝產(chǎn)物的改變
    1. 前言
    2. 材料
        2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來源及飼養(yǎng)
        2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組
        2.3 主要儀器
        2.4 試劑
    3. 實(shí)驗(yàn)方法
        3.1 高效液相色譜方法檢測(cè)葉酸（FA）、5甲基四氫葉酸（5-MeTHF），5甲酰四氫葉酸（5-FoTHF） , S腺昔甲硫氨酸（SAM），S腺苷同型半胱氨酸（SAH）的含量
        3.2 ELISA方法檢測(cè)葉酸的含量
        3.3 DHFR的活性測(cè)定
        3.4 葉酸代謝過程關(guān)鍵酶的mRNA表達(dá)水平測(cè)定
        3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    4. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.1 高效液相色譜方法檢測(cè)PMX對(duì)葉酸及相關(guān)代謝產(chǎn)物水平的影響
        4.2 ELISA方法檢測(cè)PMX對(duì)葉酸水平的影響
        4.3 PMX降低神經(jīng)管畸形小鼠胚胎的DHFR活性
        4.4 亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）和腺苷酸合成酶（TS）的mRNA表達(dá)
    5. 討論
第三部分 PMX誘導(dǎo)神經(jīng)管畸形小鼠胚胎基因組拷貝數(shù)變異的檢測(cè)及變異基因的篩選
    1 前言
    2 材料
        2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來源及飼養(yǎng)
        2.2 實(shí)驗(yàn)儀器
        2.3 實(shí)驗(yàn)試劑
    3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組
        3.2 aCGH方法檢測(cè)小鼠胚胎基因組拷貝數(shù)變異
        3.3 全基因組表達(dá)譜芯片技術(shù)篩選PMX誘導(dǎo)的NTDs小鼠胚胎組織變異基因
        3.4 RT-PCR檢驗(yàn)變異基因變化水平
        3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.1 aCGH方法檢測(cè)篩選出拷貝數(shù)變異
        4.2 全基因組表達(dá)芯片RNA質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果
        4.3 數(shù)據(jù)分析
        4.4 SAM軟件分析結(jié)果
        4.6 RT-PCR方法驗(yàn)證基因篩選結(jié)果
    5 討論
第四部分 PMX誘導(dǎo)NTDs動(dòng)物模型中胚胎干細(xì)胞DNA的改變
    1 前言
    2 材料
        2.1 細(xì)胞來源及主要試劑
        2.2 主要儀器
        2.3 試劑的配制
    3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.1 小鼠胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)
        3.2 小鼠胚胎干細(xì)胞ESC的傳代及凍存
        3.3 小鼠胚胎干細(xì)胞ESC的給藥及處理
        3.4 DHE熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）
        3.5 單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)（彗星實(shí)驗(yàn)）
        3.6 細(xì)胞內(nèi)GSH和MDA含量的測(cè)定
        3.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.1 PMX誘導(dǎo)SV129 ESC細(xì)胞中ROS水平明顯上調(diào)
        4.2 PMX誘導(dǎo)SV129 ESC細(xì)胞中DNA損傷明顯增加
        4.3 ELISA方法檢測(cè)PMX增加胚胎干細(xì)胞內(nèi)GSH和MDA的含量
    5 討論
全文小結(jié)
結(jié)論
綜述
參考文獻(xiàn)
攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的文章
致謝
個(gè)人簡(jiǎn)歷


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]丹參、川芎、紅花合煎劑對(duì)大鼠心肌缺血模型心肌細(xì)胞凋亡的影響[J]. 王曉雨,秦鋒,黃熙,張學(xué)婭,任平,趙宏衛(wèi).  中藥材. 2009(05)
[2]神經(jīng)管畸形高、低發(fā)區(qū)農(nóng)村孕早期婦女血液葉酸水平比較研究[J]. 張樂,任愛國(guó),李智文,郝玲,田熠華,李竹.  中華流行病學(xué)雜志. 2006(08)



本文編號(hào)：3000429