目的構(gòu)建小窩蛋白-1（Cav-1）重組慢病毒載體,并在293T細胞和小鼠中驗證Cav-1過表達。方法將Cav-1基因克隆至慢病毒載體GV287,然后利用酶切、PCR擴增鑒定、陽性克隆鑒定及測序驗證構(gòu)建Cav-1重組慢病毒。將Cav-1重組慢病毒轉(zhuǎn)染至293T細胞,通過熒光檢測慢病毒轉(zhuǎn)染效果,采用Western blot法檢測Cav-1蛋白表達情況,同時轉(zhuǎn)染C57BL6小鼠,免疫組化法檢測小鼠肺組織中Cav-1的表達情況。結(jié)果經(jīng)酶切、PCR擴增鑒定以及陽性克隆測序,提示Cav-1重組慢病毒構(gòu)建正確。熒光檢測顯示轉(zhuǎn)染Cav-1重組慢病毒后的293T細胞可見強熒光,Western blot法檢測結(jié)果顯示目的基因可表達,小鼠肺組織中Cav-1呈強陽性表達,且實時定量PCR檢測Cav-1重組慢病毒滴度為1.3×1012copies/ml,達到可利用標準。結(jié)論采用本研究方法可成功構(gòu)建Cav-1重組慢病毒載體。 

【文章來源】：浙江醫(yī)學. 2019,41(14)

【文章頁數(shù)】：4 頁

【部分圖文】：

目的載體酶切電泳圖（1：10kbMarker；2：載體酶切電泳；3：未酶切載體電泳）

fu/鼠濃度的Cav-1空載體病毒經(jīng)鼻腔滴注至肺內(nèi)，對肺組織中的支氣管平滑肌細胞、肺泡上皮細胞和血管內(nèi)皮細胞進行轉(zhuǎn)染；1×108pfu/鼠組、5×108pfu/鼠組和10×108pfu/鼠組分別采用1×108pfu/鼠、5×108pfu/鼠、10×108pfu/鼠3個梯度的重組慢病毒Cav-1經(jīng)鼻腔滴注至肺內(nèi)進行轉(zhuǎn)染，3d后采用免疫組化法檢測肺組織中Cav-1的表達情況。2結(jié)果2.1目的載體酶切結(jié)果以及目的基因獲取慢病毒載體經(jīng)BamHI酶切電泳后，為6kb左右的載體片段（圖1）。目的基因Cav-1（NM_007616）經(jīng)PCR擴增后獲得580bp的片段（圖2）。圖1目的載體酶切電泳圖（1：10kbMarker；2：載體酶切電泳；3：未酶切載體電泳）１２３10kb8kb6kb5kb4kb3.5kb3kb2.5kb2kb1.5kb1kb750bp500bp１２5kb3kb2kb1.5kb1kb750bp500bp250bp100bp圖2目的基因Cav-1PCR產(chǎn)物電泳圖（1：Mar-ker；2：Cav-1產(chǎn)物）·1478·

采用乙醚麻醉，固定頭部使鼻腔垂直向上。陰性對照組用1×108pfu/鼠濃度的Cav-1空載體病毒經(jīng)鼻腔滴注至肺內(nèi)，對肺組織中的支氣管平滑肌細胞、肺泡上皮細胞和血管內(nèi)皮細胞進行轉(zhuǎn)染；1×108pfu/鼠組、5×108pfu/鼠組和10×108pfu/鼠組分別采用1×108pfu/鼠、5×108pfu/鼠、10×108pfu/鼠3個梯度的重組慢病毒Cav-1經(jīng)鼻腔滴注至肺內(nèi)進行轉(zhuǎn)染，3d后采用免疫組化法檢測肺組織中Cav-1的表達情況。2結(jié)果2.1目的載體酶切結(jié)果以及目的基因獲取慢病毒載體經(jīng)BamHI酶切電泳后，為6kb左右的載體片段（圖1）。目的基因Cav-1（NM_007616）經(jīng)PCR擴增后獲得580bp的片段（圖2）。圖1目的載體酶切電泳圖（1：10kbMarker；2：載體酶切電泳；3：未酶切載體電泳）１２３10kb8kb6kb5kb4kb3.5kb3kb2.5kb2kb1.5kb1kb750bp500bp１２5kb3kb2kb1.5kb1kb750bp500bp250bp100bp圖2目的基因Cav-1PCR產(chǎn)物電泳圖（1：Mar-ker；2：Cav-1產(chǎn)物）·1478·

【參考文獻】：
期刊論文
[1]芪冬活血飲對急性肺損傷大鼠Cav-1/NF-κB炎性反應信號通路的影響[J]. 洪輝華,楊珺超,蔡宛如.  中華中醫(yī)藥雜志. 2016(01)
[2]小窩蛋白-1在急性肺損傷中的作用研究進展[J]. 謝曼潔,王德明.  現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生. 2012(15)
[3]小窩蛋白-1的生物學功能及其急性肺損傷[J]. 高磊,孫耕耘.  臨床肺科雜志. 2011(12)



本文編號：2967328